馮藜櫪，姜仁建，周 杰，王 根，袁 濤

（1.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院 重慶 401220；2.重慶市中醫(yī)院 重慶 400000）

復發(fā)性流產(chǎn)（RSA）是指處在育齡期的女性，在未改變性伴侶的情況下，與之結(jié)合受孕后，接連出現(xiàn)兩次以上的自然流產(chǎn)，并且多數(shù)發(fā)生在妊娠不超過20周時[1]。其病因至今不完全明確，主要涉及免疫、內(nèi)分泌、遺傳性疾病、子宮的先天發(fā)育異常、感染、凝血功能異常等，其中最主要的因素是免疫異常[2]。母-胎界面異常炎癥反應，及其導致的免疫平衡被打破是引發(fā)胎兒丟失的重要原因。研究表明，巨噬細胞作為哺乳動物子宮內(nèi)的主要免疫活性細胞，在調(diào)節(jié)子宮免疫微環(huán)境、介導炎性反應中發(fā)揮著重要作用[3]。巨噬細胞在不同的微環(huán)境影響下，可極化成M1型和M2型[4]。發(fā)生在任何時間、任何階段的巨噬細胞M1/M2型極化異常，均會導致自然流產(chǎn)的發(fā)生[5]。

近年來，逐年增多發(fā)生的RSA，已對生育期女性的心身健康造成了嚴重的消極影響。然而目前西醫(yī)對于治療RSA的療效有限。因此，探索效果優(yōu)良的保胎中藥及治療方法具有十分重大的價值。黃芩作為傳統(tǒng)的保胎藥物，具有清熱涼血、安胎的作用，是歷代中醫(yī)治療血熱型的胎動不安、滑胎的常用中藥。但目前對于黃芩保胎的基礎研究，報道尚少。本研究，通過觀察在黃芩干預下，RSA孕鼠模型胎盤組織病理結(jié)構(gòu)的變化，以及孕鼠胎盤組織中M1型巨噬細胞因子（iNOS、IL-6、TNF-α）和M2型巨噬細胞因子（Arg-1、IL-10）表達的變化；探討黃芩是否通過調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2型極化，參與塑造了胎盤局部母-胎界面的免疫耐受機制，從而起到安胎作用，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物及藥品制備

由北京華阜康生物科技股份有限公司提供的SPF級小鼠，包括5只BALB/C雄鼠，10只DBA/2雄鼠，30只CBA/J雌鼠，大約8周大小，平均體質(zhì)量在（20 ±2）g，許可證號SCXK（京）2019-0008；本實驗符合本單位的倫理學標準。黃芩從重慶市中醫(yī)院中藥房（重慶康美藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：210201）購得，經(jīng)重慶市中醫(yī)院藥劑科冷靜教授鑒定，為唇形科植物黃芩（S.baicalensis）的干燥根。取適量的藥材黃芩，蒸餾水浸泡，回流，提取2次，過濾，濃縮定容至濃度為1 kg·L-1黃芩水提液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。生理鹽水由重慶市中醫(yī)院購得。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素染液（批號：ZH202509，武漢塞維爾生物科技有限公司）；伊紅染液（批號：CR2011064，武漢塞維爾生物科技有限公司）；iNOS兔多克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A14031，ABclonal）；IL-6兔多克隆抗體（濃度：1∶100，貨號：bs-0782R，北京博奧森有限公司）；TNF-α兔多克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A0277，ABclonal）；Arg-1兔單克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A4923，ABclonal）；IL-10兔多克隆抗體（濃度：1∶50，貨號：A17501，ABclonal）；透射電子顯微鏡（型號JEM-1400FLASH，日本電子（JEOL））；熒光掃描顯微鏡（P250 FLASH，丹吉爾公司）等。

2 方法

2.1 實驗動物及處理

實驗分組：空白組、RSA模型組、黃芩治療組。以國際公認的經(jīng)典方法造模[6-7]，將發(fā)情的CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠按雌雄2∶1的比例合籠，使之自由交配，制造正常妊娠孕鼠模型（CBA/J×BALB/C），選取造模成功的正常妊娠孕鼠模型作為空白組；將發(fā)情的CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠按雌雄2∶1的比例合籠交配，制造復發(fā)性流產(chǎn)孕鼠模型（CBA/J×DBA/2），將造模成功的復發(fā)性流產(chǎn)孕鼠模型隨機均分為RSA模型組和黃芩治療組。合籠的第2天早晨檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)明顯陰栓者為陽性，以檢出陰栓記為孕第0天?？瞻捉M和RSA模型組均自孕1天開始連續(xù)給予生理鹽水（2 mL·kg-1·d-1）灌胃；黃芩治療組自孕1天開始連續(xù)給予黃芩水提液（10 g·kg-1·d-1）灌胃，實驗藥物劑量參考常用最佳量[8]。連續(xù)灌胃2周后脫椎取材。

2.2 統(tǒng)計胚胎丟失率

懷孕2周后，脫椎，解剖子宮，取出胚胎，記錄胚胎吸收數(shù)、胚胎存活數(shù)，計算胚胎丟失率，胚胎丟失率=吸收胚胎數(shù)/（吸收胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù)）。

2.3 HE染色檢測小鼠胎盤組織

處死孕鼠后，取胎盤組織，予以固定，脫水，包埋，切片，脫蠟至水，蘇木素染色，10-20 min后沖洗；1%鹽酸酒精分化，5-10 s后沖洗；氨水返藍，5-10 s、0.5%伊紅溶液染色，3-5 min后沖洗；脫水，透明，封片，光鏡下觀察。

2.4 透射電鏡觀察小鼠胎盤組織

取胎盤組織，雙重固定；脫水；滲透（比例分別為3∶1、1∶1、1∶3，每步 30-60 min）；純樹脂包埋，聚合，切片，染色，干燥；透射電鏡下觀察，圖像采集。

2.5 免疫熒光法檢測小鼠胎盤組織內(nèi)iNOS、IL-6、TNF-α、Arg-1、IL-10表達情況

取各組孕鼠胎盤組織，石蠟切片，乙醇脫蠟至水，浸泡，加熱沸騰，斷電，間隔5 min）后，反復1次，冷卻；PBS洗3次，每次5 min）；封閉，室溫30 min）；加一抗，4℃過夜；PBS洗 3次，每次 5 min）；加二抗，37℃30 min）；滴加DAPI，室溫孵育10 min）；PBS洗3次，每次5 min）；封片。攝取圖片，Image J圖像分析。

3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS21.0 統(tǒng)計分析軟件對采集的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù) ± 標準差（）表示，P＜ 0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 各組胚胎丟失率比較

與空白組相比，RSA模型組胚胎丟失率明顯上升，差異具統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；與RSA模型組相比，黃芩治療組胚胎丟失率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（表1）。

4.2 各組孕鼠胎盤局部的病理形態(tài)改變

HE染色，空白組胎盤組織的蛻膜帶、巨細胞滋養(yǎng)層、海綿滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)正常；與空白組對比，RSA模型組胎盤組織可見蛻膜帶局部脫落，巨細胞滋養(yǎng)層壞死，數(shù)量減少，海綿滋養(yǎng)層局灶性壞死，且出現(xiàn)了大量炎性細胞浸潤；與RSA模型組相比，黃芩治療組胎盤組織各層次結(jié)構(gòu)較清晰，僅見海綿滋養(yǎng)層點狀壞死，伴有少量炎性細胞浸潤，其他結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變（表2、圖1）。

表1 各組胚胎丟失率比較（n = 5）

表2 小鼠胎盤組織HE染色結(jié)果

圖1 小鼠胎盤病理形態(tài)學變化（HE，×400）

圖2 透射電鏡下各組小鼠胎盤組織超微結(jié)構(gòu)的變化（×8000-15000）

4.3 各組孕鼠胎盤組織TEM檢查結(jié)果

TEM下觀察各組孕鼠胎盤組織超微結(jié)構(gòu)，空白組胎盤組織的合體滋養(yǎng)層和細胞滋養(yǎng)層形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；與空白組相比，RSA模型組胎盤形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯異常，合體滋養(yǎng)層細胞疑似發(fā)生壞死，細胞核顯著皺縮，染色質(zhì)聚集，電子密度增大，胞漿內(nèi)線粒體出現(xiàn)腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張；細胞滋養(yǎng)層細胞疑似壞死；與RSA模型組相比，黃芩治療組胎盤合體滋養(yǎng)層和細胞滋養(yǎng)層未發(fā)現(xiàn)明顯異常（圖2）。

表3 小鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果（，n = 9）

表3 小鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果（，n = 9）

注：與空白組相比，*P ＜ 0.05；與RSA模型組相比，#P ＜ 0.05。

TNF-α 14.0863 ± 0.7658 18.6611 ± 0.6323*15.7321 ± 0.4751#組別空白組RSA模型組黃芩治療組iNOS 15.5444 ± 0.7089 21.7309 ± 0.6233*16.2032 ± 1.0056#IL-6 12.2734 ± 0.3700 19.0583 ± 0.5200*12.9359 ± 0.3518#

4.4 免疫熒光法檢測各組孕鼠胎盤組織中iNOS、IL-6、TNF-α、Arg-1、IL-10的表達

由表3、4及圖3、4結(jié)果顯示，與空白組相比，RSA模型組孕鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α表達均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；Arg-1、IL-10表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。與RSA模型組相比，黃芩治療組孕鼠胎盤組織iNOS、IL-6、TNF-α表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；Arg-1、IL-10表達均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（表3、表4、圖3、圖4）。

表4 小鼠胎盤組織Arg-1、IL-10平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果（，n = 9）

表4 小鼠胎盤組織Arg-1、IL-10平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果（，n = 9）

注：與空白組相比，*P ＜ 0.05；與RSA模型組相比，#P ＜ 0.05。

IL-10 26.6663 ± 0.3907 19.8832 ± 0.5709*25.7617 ± 0.4433#組別空白組RSA模型組黃芩治療組Arg-1 25.8579 ± 0.3656 18.9046 ± 0.2731*24.9819 ± 0.4823#

圖3 各組胎盤組織中iNOS、IL-6、TNF-α的免疫熒光表達（×400）

圖4 各組胎盤組織中Arg-1、IL-10的免疫熒光表達（×400）

5 結(jié)論

正常妊娠依賴于母-胎界面的各類系統(tǒng)在免疫微環(huán)境中精準的動態(tài)穩(wěn)定。任何不良因素作用于母-胎界面，誘發(fā)其免疫微環(huán)境發(fā)生異變，都有可能導致胎兒丟失[9]。簡言之，母-胎界面免疫微環(huán)境的平衡穩(wěn)定，在維持正常胚胎發(fā)育過程中起著決定性作用，是防治RSA的關節(jié)環(huán)節(jié)。

目前，西醫(yī)方面對于RSA尚無特效治療的藥物，常規(guī)治療方案多以外源性補充孕激素，如地屈孕酮、黃體酮，針對黃體功能不全的患者，這類藥物保胎療效顯著，但對其他因素引起的反復的先兆流產(chǎn)療效較差。所以，中醫(yī)藥在治療此病方面，具有不可忽視的潛在價值。RSA在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學里屬“滑胎”、“胎動不安”之列，該病的病因主要在先天胎元不固與后天氣血不調(diào)兩個方面。腎為先天之根本，主天癸，先天腎氣腎精充盛，則胎兒有所育；脾為后天之根本，脾氣充實，則氣血化生有源，使胎兒有所養(yǎng)。因此，中醫(yī)理論多以補腎健脾為安胎基本療法，目前對于安胎的中醫(yī)藥研究多集中在健脾益腎方面[10-11]。但在臨床實踐中，證候之虛、實、寒、熱不同，當根據(jù)不同辨證而論治。女子懷孕之后，氣血聚集沖任，以養(yǎng)育胎元，若素體肝氣旺盛，再遇情志不遂，或素體陽氣偏亢，則易郁生內(nèi)熱，熱擾胞宮，血為熱迫而不循常道，氣血不調(diào)，也可致胎動不安。因此，臨床辯證為“血熱”者，當調(diào)節(jié)沖任之氣血，清熱以安胎。黃芩最開始記錄于《本經(jīng)》，為唇形科植物黃芩的干燥根，朱震亨將其稱作“安胎圣藥”[12]，其性涼味苦、寒，擅于清熱、瀉火、止血、安胎[13]。臨床滑胎時辯證為血熱者，中藥湯劑中常配伍黃芩以清熱安胎[14]。因此，本研究選用黃芩干預RSA孕鼠，研究其清熱安胎的可能作用機制，為中醫(yī)臨床辨證論治以安胎提供相應的理論支持。

自1980年研究發(fā)現(xiàn)，雌性CBA/J小鼠（H-2K）與雄性DBA/2小鼠（H-2d）交配后，具有易患反復自然流產(chǎn)的特點,孕鼠流產(chǎn)率高達20%-45%，而在同為H-2K×H-2d交配方式的CBA/J×BALB/C中，孕鼠的流產(chǎn)率僅為5%-10%，這個發(fā)現(xiàn)為深入研究妊娠這一復雜生理現(xiàn)象提供了兩個經(jīng)典的動物模型，即CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠2∶1合籠，建立正常妊娠模型，將CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，建立復發(fā)性流產(chǎn)模型，這一造模方法是目前國際公認的經(jīng)典造模方法[6-7]，被廣泛用于RSA相關實驗研究[15-17]。因此，本實驗以目前國際公認的經(jīng)典造模方法制造了正常妊娠模型和復發(fā)性流產(chǎn)模型。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩治療組胚胎丟失率明顯低于RSA模型組，表明黃芩有利于降低RSA孕鼠自然流產(chǎn)風險。本實驗選用光鏡觀察了RSA孕鼠胎盤組織在細胞層面的結(jié)構(gòu)，可見造模成功的RSA孕鼠胎盤組織出現(xiàn)了蛻膜帶的部分脫落，巨細胞滋養(yǎng)層和海綿滋養(yǎng)層也出現(xiàn)了不同程度的壞死，可見壞死細胞胞核固縮、崩解，胞漿滲出，以及大量的炎性細胞浸潤，這些細胞層面結(jié)構(gòu)的病理改變促使了流產(chǎn)的發(fā)生。而經(jīng)過黃芩干預治療后，可見脫落的蛻膜恢復正常，出現(xiàn)壞死的巨細胞滋養(yǎng)層和海綿滋養(yǎng)層被修復至僅存在點狀壞死，炎性細胞大大減少，說明黃芩具有明顯改善RSA孕鼠胎盤組織顯微結(jié)構(gòu)的作用。且本實驗進一步運用了放大倍數(shù)大于光鏡1000倍的透射電鏡觀察各組孕鼠胎盤的絨毛超微結(jié)構(gòu)，包括其表面的合體滋養(yǎng)層和軸心的細胞滋養(yǎng)層，可見RSA模型孕鼠的合體滋養(yǎng)層細胞和細胞滋養(yǎng)層細胞疑似發(fā)生壞死，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯異常改變，出現(xiàn)了細胞核顯著皺縮，染色質(zhì)聚集，電子密度增大，胞漿內(nèi)線粒體大量腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張；而經(jīng)黃芩干預后的RSA胎盤絨毛超微結(jié)構(gòu)幾乎與正常孕鼠相同，說明黃芩可有效改善RSA孕鼠模型胎盤局部的超微結(jié)構(gòu)病變。綜上所述，黃芩可明顯修復RSA孕鼠胎盤局部母-胎界面的異常病理改變。

本實驗層層推進，從免疫層面入手，進一步探索了黃芩改善RSA孕鼠胎盤局部母-胎界面病理結(jié)構(gòu)的可能作用機制。妊娠期間，巨噬細胞、T淋巴細胞、及自然殺傷細胞是調(diào)控子宮局部胎盤組織免疫功能的主要免疫細胞[3]。目前，對母-胎界面免疫耐受的研究，多集中在輔助T淋巴細胞Thl/Th2型細胞因子[18-19]，而對巨噬細胞相關研究較少。但在母-胎界面的免疫耐受形成過程中，巨噬細胞同樣扮演著不可忽視的角色[20]。巨噬細胞可極化為M1型和M2型，M1型巨噬細胞高表達iNOS及大量的促炎細胞因子如IL-6、TNF-α等表面特異性標記物，M2型巨噬細胞高表達Arg-1及大量的抗炎細胞因子如IL-10等表面特異性標記物[21]。有研究表示，正常妊娠蛻膜中的巨噬細胞，M2型明顯多于M1型；而RSA患者蛻膜中的巨噬細胞則以M1型占優(yōu)勢[22]。徐春芳等[23]發(fā)現(xiàn)復發(fā)性流產(chǎn)病理妊娠狀態(tài)下，母-胎界面存在不同程度的M1/M2型巨噬細胞極化失衡。由此可見，M1/M2型巨噬細胞極化是否正常，直接影響母-胎界面促炎因子及抑炎因子的含量，關乎妊娠的成敗。抑制巨噬細胞M1型極化或促進M2型極化是調(diào)節(jié)-胎界面異常炎癥反應的重要方法，可有效抑制流產(chǎn)的發(fā)生。因此，本實驗選擇M1型巨噬細胞因子（iNOS、IL-6、TNF-α）和M2型巨噬細胞因子（Arg-1、IL-10）為檢測指標，以M1/M2型巨噬細胞極化平衡作為研究切入點，探究黃芩對RSA孕鼠胎盤組織局部母-胎界面M1/M2型巨噬細胞極化平衡的影響。

多項研究表明，黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，可在多種疾病中發(fā)揮抗炎作用，如在心肌炎和口腔炎中，黃芩苷通過抑制IL-6和TNF-α的表達，以達到明顯的消炎目的[24-25]。在脊髓損傷中，黃芩苷可通過抑制脊髓損傷大鼠脊髓組織中M1型巨噬細胞標記蛋白iNOS和M1型巨噬細胞炎癥因子（IL-12和TNF-α）的表達，促進M2型巨噬細胞標記蛋白Arg1和M2型巨噬細胞炎癥因子（IL-4和IL-10）的表達，參與抑制脊髓損傷大鼠炎癥反應過程[26]。

本研究可見，RSA模型組過表達iNOS、IL-6、TNF-α，低表達Arg-1、IL-10，提示RSA孕鼠胎盤局部出現(xiàn)了巨噬細胞向M1型傾斜，為炎癥的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了條件，而經(jīng)黃芩干預后的RSA孕鼠胎盤局部可見過量表達的iNOS、IL-6、TNF-α明顯降低，Arg-1、IL-10表達明顯增高，說明黃芩可明顯抑制M1型巨噬細胞極化，促進M2型巨噬細胞極化，抑制胎盤局部母-胎界面異常的炎癥反應。

黃芩是中醫(yī)臨床常用清熱安胎藥物，功效顯著、毒副作用小、價格低廉，廣泛應用于保胎治療。本研究結(jié)果顯示，黃芩可通過調(diào)控M1/M2型巨噬細胞極化平衡，調(diào)節(jié)RSA胎盤局部母-胎界面異常炎癥反應，明顯優(yōu)化RSA胎盤組織免疫微環(huán)境，改善其母-胎界面微觀結(jié)構(gòu)病變，對維持妊娠起到積極作用。