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電針對骨癌痛大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性因子的影響

2022-03-28 06:23:22王鳳嬌具紫勇范神棟陳灝施舍王功命梁嘉儀王珂夏勇
上海針灸雜志 2022年3期
關(guān)鍵詞:骨癌背角星形

王鳳嬌,具紫勇,范神棟,陳灝,施舍,王功命,梁嘉儀,王珂,夏勇

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,上海 200032;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437)

癌癥的發(fā)病率正在逐年上升[1],骨組織是乳腺癌和其他癌癥(包括前列腺癌、肺癌、腎癌、甲狀腺癌和肉瘤等)患者最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之一[2]。高達(dá)75%的患者忍受嚴(yán)重癌癥引起的骨痛(cancer-induced bone pain, CIBP)[3]。癌性骨痛是導(dǎo)致患者活動(dòng)受限、情緒低落、呼吸系統(tǒng)感染、栓塞、壓瘡等風(fēng)險(xiǎn)增加的主要原因,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的三階梯止痛方案進(jìn)行姑息放療和藥物治療是降低CIBP的首選治療方法,但這些方法并不總是有效且伴有嚴(yán)重的副作用[4]。中重度癌痛患者需使用阿片類藥物,存在明顯的不良反應(yīng)[5]。近年來,針灸治療癌癥疼痛日益受到關(guān)注和重視,多篇系統(tǒng)綜述和meta分析顯示針灸可能是一種癌癥疼痛有效的鎮(zhèn)痛輔助方法[6-8]。且針灸控制癌痛應(yīng)用方便,不良反應(yīng)很少,無成癮性;但針灸治療癌癥相關(guān)疼痛的機(jī)理研究尚處于初步階段,其鎮(zhèn)痛機(jī)制仍不明確。研究發(fā)現(xiàn),癌癥疼痛不僅與脊髓痛覺傳遞神經(jīng)元的興奮性有關(guān),而且與脊髓中激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞有密切聯(lián)系?;诖?本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),建立大鼠骨癌痛模型,觀察并闡明針灸對骨癌痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機(jī)制,以期為臨床治療提供借鑒和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雌性 SD大鼠 48只,清潔級(jí),體質(zhì)量(190±10)g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(滬)2013-0016],飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度21℃左右,相對濕度40%~60%的環(huán)境中,每天光照12 h,自由攝食飲水,按需更換墊料。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批轉(zhuǎn)編號(hào)為PZSHUTCM190315002。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組,每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(MGB-15533,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);GFAP抗體(ab7260,艾博抗-上海貿(mào)易有限公司);大鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒(ZC-37624,ZC-36391,ZC-36404,上海博鼎生物科技有限公司);腫瘤細(xì)胞LLC-WRC 256(Walker256,日本RCB細(xì)胞庫);電子Von-Frey(ITTC-1443,ITTC生命科學(xué)有限公司);透射電子顯微鏡(JEM-1230,日本電子株式會(huì)社廣州事務(wù)所);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200E,南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司);微量注射泵(1600528,深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 細(xì)胞制備

取成年雌性 SD大鼠腹腔注射 Walker 256細(xì)胞 0.5 mL (2.5×107/mL),6~7 d 后抽取 5 mL 大鼠腹水,加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻后 1 300 rpm離心3 min, PBS溶液重懸,計(jì)數(shù)并離心收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/mL,置于冰盒上待用。

1.4 模型制備

大鼠用麻醉機(jī)(內(nèi)含異氟烷)麻醉后,將右膝關(guān)節(jié)用7%的碘酒和75%的乙醇溶液消毒。從右側(cè)膝關(guān)節(jié)處切開皮膚,左手指固定膝關(guān)節(jié),然后用5 mL針筒針頭在膝關(guān)節(jié)髕韌帶外側(cè)緣,沿脛骨縱軸走向往脛骨遠(yuǎn)端鉆孔,深約 1 cm,用微量注射器向脛骨骨髓腔內(nèi)注射Walker 256 腫瘤細(xì)胞(5×107/mL)10 μL,假手術(shù)組大鼠注射 10 μL磷酸鹽緩沖液。注射后留針片刻,出針后針孔處放置明膠海綿,皮膚縫合[9]。

1.5 干預(yù)方法

大鼠在造模后第 11天開始電針干預(yù),隔日 1次,共 3次。選取雙側(cè)L3~L5夾脊穴(EX-B2),電針時(shí)大鼠以俯臥位安置于固定器內(nèi),用乙醇棉球消毒背部皮膚,將針灸針在L5棘突下旁開后正中線3 mm處直刺進(jìn)針,針尖抵到椎板時(shí),轉(zhuǎn)換方向朝向頭部,沿棘突旁透刺至L3水平位置,毫針連接韓式穴位神經(jīng)刺激儀,電針參數(shù)選擇頻率 2/100 Hz,疏密波,電流強(qiáng)度 2 mA,時(shí)間30 min。電針干預(yù)前3 d,所有大鼠均于固定器內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 機(jī)械痛閾測定

4組大鼠均于造模前和造模后9 d、11 d、13 d、15 d進(jìn)行機(jī)械痛閾測定。將大鼠放置在測試架上的透明有機(jī)玻璃罩內(nèi),底部是金屬網(wǎng),適應(yīng)周圍環(huán)境 15~30 min。在電子Von-Frey手持式測力傳感器上安裝聚丙烯尖端,尖端垂直于后爪的中心區(qū)域,并逐漸增加壓力,以大鼠爪子出現(xiàn)退縮動(dòng)作為準(zhǔn),收爪后記錄壓力的強(qiáng)度,以3次測量的平均值為最終結(jié)果[10]。

1.6.2 脛骨組織學(xué)觀察

大鼠安樂死后,剪斷并分離大鼠脛骨與股骨、跖骨連接的韌帶、皮膚與肌肉,生理鹽水沖洗后放入 4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24 h,按1:10的比例浸泡在脫鈣液36 h,取出上端(近股骨側(cè))三分之一,蒸餾水沖洗,用50%的乙醇溶液沖洗 2次,分別使用 70%、80%、95%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水,再用二甲苯透明處理,依次使用石蠟進(jìn)行包埋,用切片機(jī)切成4 μm的石蠟帶,將組織石蠟塊在 50 ℃水中展開,將切好的組織片放入63 ℃恒溫箱中烤片2 h,然后二甲苯、乙醇梯度脫水后蘇木精染色5 min,流水沖洗10 min,1%鹽酸乙醇溶液分化5 s,流水沖洗2 min,伊紅染色 2 min,流水沖洗后,70%、80%、95%、100%梯度乙醇脫水各 10 s,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6.3 脊髓背角組織GFAP蛋白檢測

大鼠安樂死后,縱向剪斷腰椎與骶椎及胸椎的組織連接,分離脊柱與肋骨及周圍組織以充分暴露各節(jié)段脊神經(jīng);臺(tái)盼藍(lán)標(biāo)記 L3~L5脊神經(jīng),根據(jù)標(biāo)記的脊神經(jīng)定位并分離相應(yīng)的脊髓節(jié)段,于光學(xué)顯微鏡下分離脊髓背角組織。脊髓背角組織放入蛋白裂解液中,按BCA法測定蛋白濃度。用10%的分離膠和5%的濃縮膠提取等量的蛋白液,隨后轉(zhuǎn)PVDF膜,取膜后放入5%脫脂奶粉封閉液過夜。將封閉后的膜剪成小塊后滴加一抗(1:2 000)。PBST沖洗后滴加 HRP偶聯(lián)的二抗(1:3 000)輕搖孵育。Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.6.4 脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子含量檢測

脊髓背角組織用預(yù)冷的PBS溶液沖洗、稱重后將其剪碎,與對應(yīng)體積的PBS加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。對勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融以進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞。最后將勻漿液以5 000 r/min離心5~10 min,取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作,并在波長為450 nm處,用酶標(biāo)儀測定光密度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出TNF-α、IL-1β、1L-6濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量法比較同一組不同時(shí)間點(diǎn)測量數(shù)據(jù),組間差異比較采用單因素方差分析;方差齊時(shí),采用LSD法;方差不齊時(shí),采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠機(jī)械痛閾比較

4組大鼠造模前(0 d)的機(jī)械痛閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),空白組及假手術(shù)組造模前、后各時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械痛閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白組和假手術(shù)組比較,模型組各時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械痛閾明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,電針組第 11天、13天和 15天的機(jī)械痛閾均顯著上升(P<0.05)。詳見表 1。

表1 4組大鼠右后爪機(jī)械痛閾比較 (±s, g)

表1 4組大鼠右后爪機(jī)械痛閾比較 (±s, g)

注:與空白組比較 1)P<0.05;與假手術(shù)組比較 2)P<0.05;與模型組比較 3)P<0.05

組別 n 0 d 9 d 11 d 13 d 15 d空白組 12 48.6±9.1 51.7±10.6 47.1±8.9 56.1±8.0 51.9±8.6模型組 12 49.1±12.1 24.9±6.11)2) 24.9±7.01)2) 24.7±8.81)2) 22.5±8.41)2)假手術(shù)組 12 52.8±11.2 49.5±9.7 57.3±10.3 51.9±11.7 53.1±10.7電針組 12 50.7±11.0 27.2±5.4 35.3±4.43) 40.1±6.63) 35.0±4.43)

2.2 4組大鼠脛骨組織學(xué)觀察

空白組新生骨組織內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰,軟骨細(xì)胞柱排列有序,脛骨髓腔內(nèi)未見癌細(xì)胞;假手術(shù)組過渡性骨小梁間未見癌細(xì)胞浸潤;模型組新生骨組織紋理模糊不清,軟骨細(xì)胞柱遭到破壞,髓腔內(nèi)癌細(xì)胞大量侵入;電針組過渡性骨小梁間可見大量癌細(xì)胞浸潤。詳見圖1。

圖1 各組大鼠脛骨組織病理學(xué)觀察(HE染色,×100倍)

2.3 4組大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

與空白組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6的含量均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),電針組 IL-1β、IL-6的含量低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組大鼠脊髓背角TNF-α的含量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 4組大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 (±s, pg/mL)

表2 4組大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 (±s, pg/mL)

注:與空白組比較 1)P<0.05;與假手術(shù)組比較 2)P<0.05;與模型組比較 3)P<0.05

組別 n TNF-α IL-1β IL-6空白組 6 199.65±46.27 14.18±3.76 91.81±9.68模型組 6 176.21±32.39 28.50±1.581)2) 134.78±10.411)2)假手術(shù)組 6 196.21±50.51 13.53±4.01 91.33±21.40電針組 6 189.18±54.55 20.81±5.443) 97.79±17.203)

2.4 4組大鼠脊髓背角GFAP蛋白表達(dá)水平比較

與空白組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,電針組 GFAP的蛋白表達(dá)則顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 4組大鼠脊髓背角GFAP蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

骨癌痛屬中醫(yī)學(xué)“骨瘤”范疇[11],可從軀體、心理、社會(huì)和精神等方面影響患者的生活質(zhì)量[12-13]。田建輝等[12]認(rèn)為骨癌痛的發(fā)生,責(zé)之于正虛邪實(shí),正虛為根本,邪實(shí)是表象,正虛主要表現(xiàn)于腎虛,邪實(shí)主要表現(xiàn)為伏毒,提出“伏毒蝕骨擾神”為骨癌痛核心病機(jī)。此外,有醫(yī)家認(rèn)為癌痛是瘤毒侵犯經(jīng)絡(luò)或瘤塊阻滯經(jīng)絡(luò)氣血所致[14-15]。《千金翼方》:“凡病皆由氣血壅滯,不得宣通,針以開導(dǎo)之。”[16]本實(shí)驗(yàn)選取的穴位為雙側(cè) L3~L5夾脊穴,夾脊穴可通過督脈和膀胱經(jīng)發(fā)揮效應(yīng),疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)氣血以治痛;又與心、腦、髓關(guān)系密切,來影響神氣而治痛。另一方面,下肢與 L3~L5夾脊穴屬于同神經(jīng)節(jié)段。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨癌痛是一種區(qū)別于炎性痛和神經(jīng)病理性痛的持續(xù)性、突破性疼痛[17-18],不僅與脊髓痛覺傳遞神經(jīng)元的興奮性有關(guān),而且與脊髓中激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞有密切聯(lián)系。骨癌痛模型中最具特征的改變是脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大及增生,星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)大量表達(dá)[19-20]。GFAP表達(dá)的增加,引起轉(zhuǎn)錄后修飾,導(dǎo)致脊髓促炎物質(zhì)增加神經(jīng)的興奮性,加重疼痛反應(yīng)[21]。抑制CIBP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,可有效逆轉(zhuǎn)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的上調(diào),減輕大鼠的機(jī)械痛敏[22-23]。提示星形膠質(zhì)細(xì)胞激活依賴的脊髓神經(jīng)炎在CIBP中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。研究證實(shí)針灸可緩解骨癌痛[24-25]。ZHANG R X等[26]發(fā)現(xiàn),與無電刺激對照組比較,10 Hz/2 mA電針環(huán)跳能緩解骨癌痛大鼠熱痛覺超敏,抑制脊髓 IL-1β mRNA的表達(dá);杜俊英等[27]報(bào)道電針雙側(cè)后三里和跟端穴對骨癌痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用,且治療效果與頻率、頻次無關(guān)?;谏鲜鍪聦?shí),本文觀察了電針對骨癌痛大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性因子表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過大鼠脛骨注射 Walker 256細(xì)胞建立CIBP模型,造模后第9天脛骨切片顯示,模型組新生骨組織紋理模糊不清,軟骨細(xì)胞柱遭到破壞,髓腔內(nèi)癌細(xì)胞大量侵入,空白組、假手術(shù)組均未見異常,說明CIBP造模成功;電針組過渡性骨小梁間可見大量癌細(xì)胞浸潤,表明電針干預(yù)并未改變脛骨局部組織的病理狀態(tài)。行為學(xué)檢測結(jié)果表明電針可明顯緩解 CIBP誘發(fā)的機(jī)械痛敏。進(jìn)一步研究顯示,骨癌顯著增加了脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的水平,表明星形膠質(zhì)細(xì)胞處于激活狀態(tài),這與之前的報(bào)告一致[20];而后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電針干預(yù)可顯著下調(diào)脊髓背角 GFAP的表達(dá),減少促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的釋放;4組大鼠脊髓背角TNF-α的表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明,電針對骨癌痛大鼠有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng),其可能通過抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用。

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