顓孫雪梅，周慶，孫茂民

(1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，江蘇 蘇州 215000； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

結(jié)直腸癌每年造成近70萬人死亡，成為世界上第四大致命癌癥，僅次于肺癌、肝癌和胃癌[1-2]。同種異基因干細胞移植已成為治療實體瘤如結(jié)直腸癌的有效方法[3-4]。造血干細胞移植除可治療復(fù)雜的血液系統(tǒng)惡性腫瘤外，還可誘導(dǎo)對實體器官移植的耐受[5-6]；但同時又存在移植物抗宿主等不良反應(yīng)[7-8]。上皮細胞是移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的靶細胞，其中，角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和外分泌腺等產(chǎn)生的腫瘤易受移植物抗腫瘤(graft-versus-tumor, GVT)效應(yīng)影響。在癌癥長期控制中對GVT重要性的認識使得部分患者采用非清髓性移植方案，降低了與傳統(tǒng)清髓性移植相關(guān)的發(fā)病率和死亡率[6]。非清髓性半相合細胞移植方案，即利用受體與供體小鼠有一半相同的基因型來降低GVHD反應(yīng)強度，同時延長GVT反應(yīng)時間。宿主抗原呈遞細胞可通過呈遞腫瘤抗原來激活輸注的供體淋巴細胞，從而介導(dǎo)癌細胞的清除[9]。為解決GVT反應(yīng)伴隨嚴重的移植物抗宿主等不良反應(yīng)，基于C57BL/6鼠的主要組織相容性分子背景為H-2Kb，CB6F1鼠(BALB/c × C57BL/6雜交)為H-2Kb/d，本研究以皮下種植BALB/c小鼠結(jié)腸癌CT-26細胞建立小鼠皮下荷瘤模型來評估半相合細胞移植的抗結(jié)腸癌效果。

1 材料和方法

1.1 動物、細胞與試劑

18只BALB/c小鼠[合格證號：SCXK(蘇)2017-0043]，40只C57BL/6小鼠[合格證號：SCXK(蘇)2018-0006]，6～8周齡，體質(zhì)量為24～28 g，購自蘇州大學(xué)實驗動物中心。18只CB6F1小鼠在蘇州大學(xué)實驗動物中心SPF動物室繁殖，所有小鼠均飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)實驗動物中心。動物實驗符合《實驗動物護理和使用指南》，并經(jīng)蘇州大學(xué)動物倫理委員會批準。

BALB/c小鼠結(jié)腸癌CT-26細胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和雙抗(美國Gibco公司)；ELISA試劑盒(碧云天試劑公司)；H-2Kb流式抗體和H-2Kd流式抗體(美國Abcam公司)；HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)；環(huán)磷酰胺(源葉生物科技有限公司)。

1.2 皮下荷瘤小鼠模型構(gòu)建及半相合細胞移植

1.2.1 供體小鼠脾細胞和骨髓細胞的獲取 取40只C57BL/6小鼠，脫頸處死后75%乙醇浸泡 2 min；取小鼠脾和下肢分別放入含有PBS的培養(yǎng)皿中。取脾臟剪碎并研磨，將研磨液轉(zhuǎn)移至200目的細胞篩網(wǎng)中過濾；用PBS沖洗篩網(wǎng)2次；4 ℃離心棄上清液；加入2 mL紅細胞裂解液4 ℃靜置10 min；加入10 mL PBS終止裂解；離心棄上清液，PBS洗滌2次，即得到小鼠脾細胞。

取小鼠下肢用眼科鑷分離皮膚和肌肉，獲取小鼠脛骨和股骨，用紗布將脛骨和股骨處肌肉去除干凈，剪去兩端軟骨暴露紅色骨髓腔，1 mL無菌注射器吸取PBS反復(fù)沖洗2～3次，沖洗液后續(xù)處理同上述小鼠脾細胞，即得小鼠骨髓細胞。

1.2.2 荷瘤模型構(gòu)建 選取18只健康CB6F1小鼠，隨機均分為3組，即對照組、環(huán)磷酰胺組和移植組，每組6只，均皮下注射5×106個CT-26結(jié)腸癌細胞(0.2 mL)，即為受體小鼠。7 d時可檢測到小鼠腫瘤體積，表明模型構(gòu)建成功。

1.2.3 半相合細胞移植 對照組于小鼠尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水；環(huán)磷酰胺組注射0.2 mL環(huán)磷酰胺；移植組在2 d時先注射0.2 mL環(huán)磷酰胺，以后注射0.2 mL 5×107個脾細胞+2×107個骨髓細胞；2次/周，連續(xù)注射4周；于移植后2、7、12、17、23、28 d時測量小鼠腫瘤體積。

2周時對照組小鼠荷瘤過大死亡；環(huán)磷酰胺組和移植組分別處死3只取其腫瘤組織、肝臟、小腸和皮膚行后續(xù)HE染色和ELISA檢測等。

1.3 HE染色觀察組織病理變化

取移植2周時3組小鼠肝臟、皮膚、小腸及腫瘤組織，石蠟包埋，切片4～6 μm；二甲苯脫蠟3次，每次7 min；乙醇梯度水化，無水乙醇、95%乙醇和75%乙醇各3 min；自來水沖洗1 min；蘇木精染色2 min；自來水沖洗5～10 min；1%鹽酸乙醇分化 3 s；自來水終止分化；1%伊紅染液染色20 s；自來水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 ELISA法檢測腫瘤組織中炎性因子水平

分別取3組小鼠腫瘤組織，加入組織勻漿緩沖液研磨，離心取上清液。將標(biāo)準品和樣品加入微孔板中孵育1.5 h后洗滌3次，于各孔中加入稀釋好的生物素化抗體 (IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β) 工作液100 μL孵育1 h；洗去未結(jié)合的生物素化抗體；每孔加入HRP結(jié)合的鏈—霉親和素，室溫孵育20 min；洗滌2次；每孔加入TMB溶液100 μL，室溫避光孵育20 min；終止顯色，待顏色從藍色變?yōu)辄S色時于450 nm處測量光密度值。

1.5 流式細胞儀檢測小鼠外周血嵌合比率

于移植3 d，2周和4周時取未處死的同樣3只移植組小鼠眼球血80 μL，加入紅細胞裂解液2 mL避光4 ℃孵育10 min；PBS洗滌2次，加入抗H-2Kb、H-2Kd抗體避光室溫孵育30 min；PBS洗滌2次；加入200 μL PBS，用流式細胞儀檢測小鼠外周血嵌合率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 半相合細胞移植抑制腫瘤生長

移植2 周時對照組小鼠荷瘤過大死亡，環(huán)磷酰胺組和移植組小鼠腫瘤體積明顯小于對照組(P均<0.01)；移植2、7、12、17、23 d時，移植組小鼠腫瘤體積小于環(huán)磷酰胺組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；移植28 d時，移植組腫瘤體積顯著小于環(huán)磷酰胺組(P<0.01)。見圖1。

a: P<0.01，與對照組比較； b: P<0.01，與移植組比較；A：移植2周時各組小鼠腫瘤體積比較(n=3)； B：不同時間點兩組小鼠腫瘤體積比較(n=3)；C：移植4周時兩組小鼠腫瘤體積(n=3)

2.2 受體鼠的移植物抗宿主反應(yīng)

HE染色結(jié)果顯示，移植組肝組織匯管區(qū)淋巴細胞數(shù)少于環(huán)磷酰胺組，且組織排列整齊，未見明顯分離；移植組腸黏膜完整，且淋巴細胞數(shù)少于環(huán)磷酰胺和對照組；移植組皮膚無明顯淋巴細胞浸潤，部分上皮細胞壞死，另外兩組皮膚組織有大量淋巴細胞浸潤和基底層空泡樣病變。見圖2。

圖2 各組小鼠肝臟、小腸和皮膚組織HE染色結(jié)果(scale bar=100 μm)

2.3 半相合細胞移植改變腫瘤部位的免疫微環(huán)境

HE染色結(jié)果顯示(圖3)，移植2周時，與環(huán)磷酰胺組和對照組相比，移植組小鼠腫瘤組織浸潤淋巴細胞數(shù)增多。與對照組相比，環(huán)磷酰胺組腫瘤相關(guān)因子含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；與對照組和環(huán)磷酰胺組相比，移植組腫瘤組織中IL-2、IL-10、IFN-γ與TNF-α含量明顯增高(P均<0.05)，IL-4和TGF-β 含量明顯降低(P均<0.05)。見圖4。

圖3 各組小鼠腫瘤組織HE染色(scale bar=100 μm)

2.4 供體來源的淋巴細胞參與GVT反應(yīng)

與移植3 d時相比，移植2、4周時移植組CB6F1小鼠外周血中H-2Kb所占比例顯著增加(P均<0.01)。見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測移植組小鼠不同時間點外周血嵌合率

3 討論

產(chǎn)生GVT和GVHD的主要原因是白細胞抗原不匹配[11]。因此本研究采用皮下種植CT-26結(jié)腸癌細胞的小鼠作為研究模型，采用骨髓細胞和脾細胞靜脈注射非清髓治療的方法，結(jié)果顯示4周時移植組結(jié)直腸腫瘤體積顯著小于環(huán)磷酰胺組，由此表明，先注射環(huán)磷酰胺降低小鼠免疫力，再進行半相合細胞移植具有明顯的、長期的移植物抗結(jié)直腸癌效應(yīng)。研究表明，GVHD反應(yīng)與小鼠肝、小腸和皮膚組織有關(guān)[12-13]。本研究HE染色結(jié)果顯示，移植組中GVHD反應(yīng)顯著改善，由此表明免疫原性降低的半相合細胞移植對結(jié)直腸癌的治療效果良好。

免疫環(huán)境由腫瘤白細胞的浸潤程度、功能狀態(tài)和組織所決定，可反映患者預(yù)后、治療反應(yīng)預(yù)測等相關(guān)信息[14-15]。本研究結(jié)果顯示，移植組小鼠移植后2周腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)顯著增加，提示半相合細胞移植可以重塑腫瘤微環(huán)境。研究表明，IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β細胞因子含量與腫瘤微環(huán)境相關(guān)[15]。 IFN-γ和IL-2屬于Th1型細胞因子，可促進T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，促進NK細胞和巨噬細胞活化，發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。IL-4和IL-10屬于Th2型細胞因子，可調(diào)節(jié)肥大細胞或嗜酸性粒細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。TNF-α是由免疫細胞分泌的具有抑制腫瘤細胞生長和誘導(dǎo)腫瘤退行性變化的細胞因子[17]。本研究結(jié)果顯示，與環(huán)磷酰胺組相比，移植組IL-2、IL-10、IFN-γ與TNF-α細胞因子含量顯著升高，IL-4和TGF-β表達水平明顯降低，由此表明移植組小鼠腫瘤免疫微環(huán)境得到改善，半相合細胞移植可增強腫瘤的免疫應(yīng)答。研究表明，供者細胞比例越高，移植物抗腫瘤效應(yīng)越強[18-19]。本研究結(jié)果顯示，移植后2、4周移植組小鼠H-2Kb 所占比例較3 d時顯著增加 ，表明半相合細胞供者來源的骨髓細胞和淋巴細胞參與GVT效應(yīng)。

綜上所述，半相合細胞移植后靜脈注射環(huán)磷酰胺可誘導(dǎo)長期免疫耐受，降低GVHD反應(yīng)的同時改善了抗結(jié)腸癌的作用時間和強度，但具體機制有待進一步研究。