劉蘭蘭，王志新，袁思銳，石春燕，盧子文，胡興，劉晗青，屠志剛

(1. 江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 3. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1-2]。傳統(tǒng)的化療藥物不良反應(yīng)大，總體療效差。近年來，選擇性高、不良反應(yīng)小的靶向藥物已成為抗卵巢癌新藥研發(fā)領(lǐng)域的熱點，其中包括了血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制劑[3]、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制劑[4-5]等。PARP抑制劑是一類新興的、基于協(xié)同殺傷機(jī)制的卵巢癌靶向治療藥物[6]。PARP抑制劑可以選擇性殺死DNA雙鏈斷裂同源重組修復(fù)機(jī)制不完整的癌細(xì)胞，而對正常細(xì)胞作用輕微。早期研究發(fā)現(xiàn)，PARP抑制劑對于具有乳腺癌易感(breast cancer susceptibility，BRCA)基因缺陷的卵巢癌患者有很好的治療效果。然而，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑對于很多沒有BRCA基因缺陷的患者也非常有效[7]?？紤]到DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)需要多種蛋白的共同調(diào)節(jié)[8]，因此推測卵巢癌患者中普遍存在DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)機(jī)制的障礙。

已有研究顯示，DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)需要數(shù)十個蛋白協(xié)同完成。其中研究最多的有乳腺癌易感1(BRCA1)、乳腺癌易感2(BRCA2)、DNA修復(fù)蛋白RAD51和范可尼貧血D2蛋白(FANCD2)等[9-11]。將具有DNA雙鏈斷裂修復(fù)障礙的卵巢癌患者從紛繁復(fù)雜的卵巢癌病例中鑒定出來，進(jìn)一步使用PARP抑制劑對其進(jìn)行個性化治療，將具有很好的臨床應(yīng)用前景和社會價值?；谝陨峡紤]，本研究采用免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemistry，IHC)檢測上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)組織中BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2的表達(dá)，并應(yīng)用GEPIA和Ualcan分析它們與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院2007年1月至2018年12月未經(jīng)治療的EOC患者的術(shù)后組織標(biāo)本，去除轉(zhuǎn)移癌和分類不明確的癌組織，最終保留了84例符合標(biāo)準(zhǔn)的EOC組織標(biāo)本。對84例EOC按照WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，包括漿液性卵巢癌55例、黏液性卵巢癌16例和卵巢透明細(xì)胞癌13例；根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期55例。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，腹膜轉(zhuǎn)移39例。患者的平均年齡為54歲，<50歲患者56例。

篩選標(biāo)準(zhǔn)： ① 確診前患者未患過任何重大疾??；② 未采用過其他附加治療手段；③ 手術(shù)后獲得的癌組織均用石蠟包埋制成包埋塊，并通過HE染色后由病理學(xué)研究人員進(jìn)行專業(yè)鑒定，確定有無病變。另收集6例正常卵巢組織作為對照。本研究經(jīng)過江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

BRCA1抗體(美國Milllipore公司)；BRCA2抗體、FANCD2抗體、RAD51抗體(美國Abcam公司)；人鼠通用型二抗、免疫組化試劑盒和DAB染液購自基因科技(上海)股份有限公司；蘇木素和伊紅染液購自珠海貝素生物公司；其他IHC試劑如無特殊說明，均購自國藥集團(tuán)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

標(biāo)本均用石蠟包埋，切成厚度為4 μm的組織薄片；刷子緩慢移動組織薄片至提前加熱的水浴鍋做展片處理，1～2 min后使用載玻片將其撈出放于烤片機(jī)上3～5 min使其完全貼附于載玻片上；脫蠟處理并進(jìn)行抗原修復(fù)及過氧化氫封閉后；將4種抗體用PBS按合適比例稀釋后(BRCA1和BRCA2按1 ∶200稀釋，RAD51和FANCD2按1 ∶100稀釋)，滴于石蠟標(biāo)本上，并置于4 ℃冰箱中孵育過夜；之后按照DAB顯色液操作方案對切片顯色；最后蘇木素染色后脫水封片。

由兩位研究人員對染色結(jié)果進(jìn)行雙盲確認(rèn)，對陽性細(xì)胞的染色強度以及在整張切片中的占比進(jìn)行評分。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無棕黃色0分，淡棕黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細(xì)胞占比評分標(biāo)準(zhǔn)：無陽性細(xì)胞即為0分，陽性細(xì)胞1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。每個視野評分為陽性細(xì)胞的染色強度分值與占比分值的乘積[12]。每個病例的評分取兩位評分人員分?jǐn)?shù)的平均值。

1.4 使用GEPIA分析BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2基因在EOC組織中的表達(dá)

通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)平臺分析TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫中4種基因在EOC組織及癌旁組織中的mRNA表達(dá)，以驗證本次實驗數(shù)據(jù)的可靠性。設(shè)置篩選條件如下，① Gene:BRCA1/BRCA2/RAD51/FANCD2；② Differential Methods: ANOVA；③ |Log2(FC)|>1；④ 顯著性參數(shù)q-value Cutoff: 0.01；⑤ Cancer name: OV。

使用GEPIA中Spearman分析法對TCGA數(shù)據(jù)庫中BRCA1、BRCA2、RAD51及FANCD2mRNA表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.5 使用Ualcan分析BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2基因表達(dá)與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系

使用Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫中BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2的mRNA表達(dá)與EOC患者年齡、腫瘤組織學(xué)分級、種族和TP53突變情況之間的關(guān)系。設(shè)置篩選條件如下，① enter gene symbol：BRCA1/BRCA2/RAD51/FANCD2；② TCGA dataset：OV。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。4種蛋白在EOC和正常卵巢組織中的表達(dá)差異采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRCA1、BRCA2、 RAD51和FANCD2蛋白在EOC組織中的表達(dá)

IHC染色結(jié)果顯示，BRCA1 、BRCA2、 RAD51和FANCD2蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布(圖1)。對IHC切片進(jìn)行評分顯示，BRCA1蛋白在EOC組織和正常卵巢組織間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其他3種蛋白在EOC組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常卵巢組織，見表1。

圖1 4種蛋白在不同組織學(xué)類型EOC組織中的陽性表達(dá)(免疫組化，標(biāo)尺100 μm，×200)

表1 4種蛋白在EOC組織和正常卵巢組織中的表達(dá)

2.2 BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2 mRNA在EOC組織中的表達(dá)

GEPIA分析結(jié)果顯示，與正常卵巢組織相比，BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2的mRNA相對表達(dá)量在EOC組織中明顯上升(圖2A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而且它們的表達(dá)水平兩兩之間均呈明顯正相關(guān)(圖2B)。

圖2 GEPIA分析EOC組織BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2 mRNA表達(dá)及相關(guān)性

2.3 BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2 mRNA表達(dá)與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系

Ualcan分析結(jié)果顯示，BRCA1mRNA在41歲以上患者中的表達(dá)明顯高于41歲以下患者(圖3A)。4種基因在EOC組織學(xué)2級及以上腫瘤中的mRNA表達(dá)均較高，其中，RAD51mRNA在3級腫瘤中的表達(dá)顯著高于2級(圖3B)。FANCD2mRNA在非洲裔人種中的表達(dá)顯著高于白種人(圖3C)，其他mRNA表達(dá)在不同人種中無顯著差異。TP53突變的EOC組織中BRCA1、RAD51和FANCD2mRNA表達(dá)顯著高于TP53未突變EOC組織(圖3D)。

*： P<0.05，#： P<0.01

3 討論

BRCA1和BRCA2是經(jīng)典的抑癌基因，在DNA雙鏈斷裂同源重組修復(fù)中起舉足輕重的作用[13-14]。此外，在同源重組修復(fù)中，RAD51蛋白起到了鏈間交換的作用，斷裂DNA發(fā)出的損傷信號會使FANCD2蛋白激活并與BRCA1蛋白轉(zhuǎn)移至損傷位點修復(fù)DNA[15]。雖然BRCA1、BRCA2、RAD51蛋白在同源重組修復(fù)中起到重要作用，但根據(jù)前人研究[7]，卵巢癌中還存在其他多種同源重組基因缺陷，復(fù)雜的同源重組修復(fù)過程可能由于某一種蛋白的缺陷而發(fā)生改變[8]。有研究顯示[7]，BRCA2和RAD51基因突變可以促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明，除了BRCA1與正常對照無顯著差異外，BRCA2、RAD51和FANCD2蛋白在EOC組織中均高表達(dá)。研究證實BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2蛋白在多種癌癥中過表達(dá)，而且這些蛋白的過表達(dá)有可能是患者不良預(yù)后的指標(biāo)[16-19]。隨后，通過GEPIA對TCGA數(shù)據(jù)庫BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2基因在EOC組織中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)與正常卵巢組織相比，以上4種基因的mRNA表達(dá)水平均明顯升高，且兩兩之間均呈正相關(guān)。 Ualcan分析顯示EOC組織中BRCA1、BRCA2、RAD51和FANCD2的mRNA表達(dá)與患者年齡、腫瘤組織分級、種族及TP53突變情況明顯相關(guān)。BRCA2、RAD51和FANCD2蛋白的高表達(dá)提示在卵巢癌中可能存在DNA雙鏈斷裂同源重組修復(fù)通路的持續(xù)激活。同源重組修復(fù)發(fā)生缺陷會改變基因組穩(wěn)定性，常常促使細(xì)胞癌變[20]。EOC的發(fā)生可能與持續(xù)存在的DNA雙鏈斷裂修復(fù)相關(guān)[21]。本研究結(jié)果提示，BRCA2、RAD51和FANCD2蛋白有望成為診療卵巢癌新的標(biāo)志物。

卵巢癌中之所以會出現(xiàn)持續(xù)激活的DNA雙鏈斷裂修復(fù)現(xiàn)象，可能是因為DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路的某些節(jié)點發(fā)生紊亂，從而對DNA損傷修復(fù)有關(guān)途徑造成阻礙；未能被及時修復(fù)的DNA損傷位點會持續(xù)發(fā)出信號以招募DNA損傷修復(fù)蛋白累積至損傷位點；上述兩個過程相互促進(jìn)，惡性循環(huán)，導(dǎo)致了DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路持續(xù)激活卻又無法有效修復(fù)DNA損傷的現(xiàn)象。綜上所述，本研究結(jié)果為探索基于PARP抑制劑的卵巢癌靶向治療提供了新策略。