趙 卓，籍昊天，，肖業(yè)臣

(1.吉林師范大學生命科學學院，吉林 四平 136000；2.吉林大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，吉林 長春 130021)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone morphogenetic protein 4，BMP4)是骨形成蛋白家族的一員，隸屬于TGF-β超家族，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、干細胞分化和成人組織穩(wěn)態(tài)等方面起重要的調(diào)控作用[1].Kl?sch等[2-3]將鼠源BMP4在重組大腸桿菌中進行了表達，但表達系統(tǒng)不能對外源蛋白進行修飾，會形成不溶解、無活性的包涵體，并存在后期蛋白復性實驗煩瑣、復性率較低等問題；Cha等[4-5]將人源BMP4在中國倉鼠卵巢細胞中進行了表達，結果證明哺乳動物活細胞表達系統(tǒng)在大量生產(chǎn)蛋白時成本較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn).在BMP4蛋白純化方面，普遍選擇使用親和層析技術，如免疫親和層析、染料-配體親和層析、固定化金屬離子親和層析等[6]，但親和層析技術雖然操作方便，卻同樣存在成本較高、不宜大規(guī)模生產(chǎn)等問題.因此，優(yōu)化BMP4表達方法、提高利用效率、降低純化成本，對后續(xù)研發(fā)和生產(chǎn)至關重要.

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前較為常見的表達系統(tǒng)之一，其優(yōu)點在于表達高效、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低，可根據(jù)需要選擇胞內(nèi)或胞外分泌路徑.其中，胞外分泌表達純化工藝簡單、生產(chǎn)成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)[7].離子交換層析方法可以根據(jù)電荷性質差異分離電離分子，具有處理能力強、適用廣泛、成本適中等優(yōu)點，同時還有易于放大和自動化處理等特性，在大批量生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用.本文通過設計合成BMP4-Fc目的基因序列，利用巴斯德畢赤酵母作為BMP4表達系統(tǒng)，采用離子交換層析法分離、純化目的蛋白，通過BMP4形成二聚體時具有促進間充質干細胞增殖的特性，驗證了BMP4-Fc融合蛋白的活性.

1 材料及方法

1.1 實驗材料

實驗所需材料、試劑分別為：限制性內(nèi)切酶Xho I、Xba I、Sac I和限制性內(nèi)切酶緩沖液(美國NEB公司)；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物(英國OXOID公司)；DNA電泳標準品(Marker)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)標準品(Marker)和增強型化學發(fā)光試劑(中國全式金公司)；博來霉素(美國Invitrogen公司)；質粒小提試劑盒、質粒大提試劑盒、切膠回收試劑盒(中國康為公司)；載體pPICZα(中國南京中鼎生物公司)，X33畢赤酵母(中國華越洋生物公司)；BMP4單克隆抗體、Fc單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體(中國Bioss公司)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)(美國Millipore公司)；PCR mix酶和BMP4蛋白(中國聚合美公司)；細胞計數(shù)試劑(cell counting Kit-8，CCK-8)(美國MedChem Express公司).聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)引物設計合成由中國生工公司完成.

1.2 載體構建

1.2.1 引物設計

在美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information)進行蛋白質檢索，獲得BMP4的氨基酸序列(登錄號：NP 001193.2)，設計合成蛋白基因序列(由南京鐘鼎公司完成).合成基因全長1 169 bp，在5′端插入Xho I限制性內(nèi)切酶酶切位點，在3′端插入Xba I和Sac I限制性內(nèi)切酶酶切位點(由南京鐘鼎公司完成)，并保存于大腸桿菌中.

1.2.2 構建BMP4-Fc表達載體

取10 μL大腸桿菌培養(yǎng)液，加至150 mL含博來霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng).當D(600)=0.6～0.8時，用質粒大提試劑盒進行質粒提取，用Xho I、Xba I限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定，并將質粒送到上海生工公司進行測序和驗證.確認重組質粒準確無誤后，用Sac I限制性內(nèi)切酶進行單酶切，線性化質粒經(jīng)DNA凝膠電泳、切膠回收試劑盒回收，-20 ℃保存.

1.2.3 制備重組質粒X33畢赤酵母

將X33畢赤酵母制備成感受態(tài)酵母細胞后與線性化重組質粒混合，將混合液加入電轉杯，在BTXecm830型方波電穿孔儀中進行電轉化.轉化后的酵母菌在28 ℃的培養(yǎng)箱中靜置2 h后，取部分菌液涂布在含有100 μg/mL博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板培養(yǎng)基中，倒置培養(yǎng)24～48 h.

1.2.4 鑒定克隆載體

挑選長勢良好的菌落接種于含有博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)至底部出現(xiàn)菌種沉淀，吸取100 μL菌液進行PCR.將菌液懸浮充分混勻后取500 μL加入到50 mL含甘油的緩沖性完全培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng).D(600)=2～6時，將酵母菌轉移至含甲醇的緩沖性復合培養(yǎng)基中培養(yǎng).每24 h補充1%甲醇誘導分泌蛋白.96 h后收取上清液進行蛋白印跡 (Western-blot)測定，觀察目標蛋白位置及分泌量，選擇分泌較好的酵母菌菌種保存.

1.2.5 優(yōu)化重組菌種誘導條件

取重組菌種進行培養(yǎng)，分別設置0，1%，2%，3%，4%，5%的甲醇溶液進行誘導實驗，取不同組上清液進行SDS-PAGE和Western-blot測定，使用Fc和BMP4抗體檢測重組蛋白表達量.

1.3 分析重組蛋白活性

1.3.1 重組蛋白純化

取上清液用超濾管濃縮提純，將濃縮蛋白進行陰離子交換層析，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液沖洗.用20 mmol/L Tris-HCl和不同濃度NaCl混合液分3次洗脫.每次洗脫過程中，NaCl濃度依次設置為100，50，10 mmol/L.

1.3.2 重組蛋白活性測定

復蘇間充質干細胞，將培養(yǎng)細胞接種到96孔板中，每孔接種1萬個細胞.將磷酸緩沖鹽溶液、標準蛋白樣品、純化重組蛋白樣品分別加入到培養(yǎng)孔中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h；向樣品孔中加入10 μL CCK-8試劑，輕微震蕩混勻，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h，利用酶標儀檢測樣品D(450)值.

1.4 結果分析

使用IBM SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并對實驗數(shù)據(jù)進行ANNOVA分析，顯著性水平P<0.05.

2 結果與分析

2.1 質粒單雙酶切鑒定

通過Sac I限制性內(nèi)切酶進行單酶切，將質粒線性化，結果見圖1.通過Xho I、Xba I限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，得到的目的片段結果見圖2，單酶切和雙酶切結果顯示，目的基因己插入，目的質粒構建成功.

1重組質粒，2重組質粒BMP4-Fc

1重組質粒，2重組質粒BMP4-Fc

2.2 重組質粒X33畢赤酵母鑒定與篩選

將目的質粒通過電轉化法構建重組X33畢赤酵母表達載體，酵母菌菌落PCR實驗結果見圖3，結果顯示2，3，4號菌種有PCR產(chǎn)物，證明目的基因已導入到酵母菌中.SDS-PAGE實驗結果見圖4，結果顯示在相對分子質量為45 000 處，1—4號菌種均有蛋白分泌.

1—4菌種編號，5其他質粒，6雙蒸水

1菌種1培養(yǎng)0 h，2菌種1培養(yǎng)48 h，3菌種2培養(yǎng)0 h，4菌種2培養(yǎng)48 h，5菌種3培養(yǎng)0 h，6菌種3培養(yǎng)48 h，7菌種4培養(yǎng)0 h，8 菌種4培養(yǎng)48 h

2.3 誘導條件優(yōu)化

用不同質量分數(shù)的甲醇對同一菌種進行誘導，SDS-PAGE驗證結果(見圖5)表明，1%，2%和3%的甲醇誘導，在相對分子質量為45 000 處均有蛋白條帶.用Fc抗體和BMP4抗體進行Western-blot檢測，結果(見圖6、圖7)發(fā)現(xiàn)，1%甲醇誘導的酵母菌分泌的目的蛋白較多.將同一菌種用1%甲醇連續(xù)誘導96 h，SDS-PAGE實驗結果(見圖8)表明，誘導72和96 h的酵母菌分泌的蛋白結果相同，說明甲醇誘導畢赤酵母表達蛋白最優(yōu)時間為72 h.

1—6：0，1%，2%，3%，4%，5%甲醇誘導蛋白表達上清液

1—6：0，1%，2%，3%，4%，5%甲醇誘導蛋白表達上清液

1—6：0，1%，2%，3%，4%，5%甲醇誘導蛋白表達上清液

1—5：培養(yǎng)0，24，48，72，96 h誘導蛋白表達上清液

2.4 重組蛋白純化

重組蛋白陰離子交換層析：將蛋白原液加入陰離子柱，用20 mmol/L Tris-HCl和不同濃度梯度的NaCl混合液進行洗脫.當NaCl濃度為100 mmol/L時，洗脫結果見圖9，目的蛋白被300 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫；當NaCl濃度為50 mmol/L時，洗脫結果見圖10，目的蛋白被250 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫；當NaCl濃度為10 mmol/L時，洗脫結果見圖11，目的蛋白被230 mmol/L NaCl和 20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫，說明該濃度洗脫液可得到較高純度目的蛋白.

1：蛋白原液；2：流穿液；3：20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；4：100 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；5：200 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；6：300 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；7：400 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；8：1 000 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰

1：經(jīng)過30 000超濾管濃縮的蛋白原液；2：20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；3：200 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；4：250 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；5：300 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；6：1 000 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰

1：蛋白原液；2：200 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；3：220mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；4：230mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；5：300 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰；6：1 000 mmol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl洗脫峰

2.5 重組蛋白活性測定及數(shù)據(jù)分析

分別用磷酸緩沖鹽溶液、商品化BMP4與純化后的BMP4-Fc，對間充質干細胞進行刺激，培養(yǎng)48 h后加入10 μL細胞計數(shù)試劑CCK-8培養(yǎng)2 h，用酶標儀檢測D(450)值，結果見圖12.分析結果顯示，商品化BMP4組D(450)比PBS組顯著增高，BMP4-Fc組D(450)比PBS組顯著增高，商品化BMP4組D(450)略高于BMP4-Fc組但差異不顯著，說明BMP4-Fc對間充質干細胞的刺激程度較低，接近商品化BMP4對間充質干細胞的刺激水平.

*P<0.05

3 討論

蛋白類藥物通過血液進入體內(nèi)循環(huán)時，由于半衰期比較短通常需要對患者加大給藥劑量，因而會產(chǎn)生副作用.BMP4作為骨形成蛋白家族的一員，對其生理活性的研究與功能開發(fā)利用一直受到眾多學者的重視.近年來對IgG-Fc標簽的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)Fc標簽可以促進蛋白形成穩(wěn)定二聚體，可延長在血液中的半衰期，降低蛋白免疫原性，從而減少患者給藥量、減輕對患者的毒副作用.本文依據(jù)BMP4可通過形成二聚體發(fā)揮其生理作用的特點，在BMP4基因組中加入了IgG-Fc標簽.研究結果顯示，當BMP4與IgG-Fc融合后會促使BMP4-Fc融合蛋白形成不易降解的穩(wěn)定二聚體；同時，BMP4-Fc融合蛋白對間充質干細胞的增殖具有明顯的促進作用，說明在BMP4中加入IgG-Fc形成二聚體后可以更好地發(fā)揮生理活性.

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)可對目的蛋白進行翻譯后修飾，具有高效分泌表達的真核表達系統(tǒng).有研究報道，整合到畢赤酵母基因組內(nèi)目的基因的拷貝數(shù)量決定畢赤酵母表達系統(tǒng)分泌的蛋白量，但本文進行的PCR目的基因擴增和初步誘導表達實驗結果與這種情況并不相符，表明不同蛋白在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達量存在差異.為此，本文進一步純化了重組蛋白、優(yōu)化了DEAE離子交換層析條件，發(fā)現(xiàn)在230 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl混合液洗脫條件下，可以除去大部分雜蛋白，得到純度較高、生理活性好、接近商業(yè)化純品水平的目的蛋白，為BMP4的進一步研究、開發(fā)和利用提供了參考依據(jù).