曹 冰，任 榮，陸 晨

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

糖尿病腎病是糖尿病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，約有40%的糖尿病患者伴有不同程度的腎臟損傷，最終導(dǎo)致終末期腎臟病的發(fā)生[1]。目前糖尿病腎病的治療以降低血糖、控制尿蛋白排泄為主，從而延緩腎臟病的進(jìn)展。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)抑制劑是一種新型的降糖藥物，其通過(guò)抑制SGLT2的轉(zhuǎn)運(yùn)作用使腎臟對(duì)葡萄糖重吸收減少，促進(jìn)尿糖、尿鈉的排出而發(fā)揮降糖作用[2]，同時(shí)具有減少蛋白尿排泄、改善腎纖維化等腎臟保護(hù)作用[3]。Ⅰ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的成分之一,是腎臟內(nèi)主要的間質(zhì)性膠原，其含量過(guò)多可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的異常堆積，最后導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察SGLT2抑制劑卡格列凈對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能、腎臟纖維化及腎組織中I型膠原蛋白表達(dá)的影響，探討了其腎臟保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠28只，8～10周齡，體重200～250 g，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0003，于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行繁育。飼養(yǎng)溫度(23±3)℃，相對(duì)濕度40%～70%。研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(IACUC-20210425-14)。

1.2主要試劑 45%高脂飼料(日糧型，大鼠)，普通飼料(江蘇協(xié)同公司)；鏈脲佐菌素(sigma公司)；卡格列凈片(Janssen-CilagS.p.A.意大利，國(guó)藥準(zhǔn)字H20170375，規(guī)格：100 mg)；蘇木素染液、伊紅染液、中性樹膠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(南京建成)；Rabbit Anti-Collagen I antibody(博奧森)。

1.3主要儀器 羅氏血糖儀家用血糖試紙(羅氏卓越型)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司，DNP-9272)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad xMarkTM)；高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)；漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；電泳儀(北京六一DYCZ-21)；化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司Chemiscope 3000)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將28只雄性SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(8只)、糖尿病腎病組(10只)、卡格列凈組(10只)。正常組大鼠繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病腎病組和卡格列凈組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。于分組喂養(yǎng)第5周第1天，糖尿病腎病組和卡格列凈組給予鏈脲佐菌素50 mg/kg(pH 4.45、0.01 mol/L無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)腹腔注射，正常組注射等體積溶劑。注射第3天測(cè)隨機(jī)血糖1次，對(duì)血糖低于11.1 mmo/L的大鼠再注射鏈脲佐菌素50 mg/kg，7 d后連續(xù)3 d尾靜脈取血測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmo/L，且尿白蛋白升高，出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重下降的典型“三多一少”癥狀，毛發(fā)枯黃、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等則證明造模成功。次日開始卡格列凈組給予卡格列凈10 mg/kg灌胃，正常組及糖尿病腎病組給予等體積蒸餾水灌胃，均1次/d，持續(xù)灌胃37 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1尿蛋白含量 注射鏈脲佐菌素第1，2，3天及灌胃37 d處死前1 d收集各組大鼠24 h尿液，保存于-80 ℃冰箱,采用尿蛋白定量測(cè)試盒檢測(cè)尿蛋白定量。

1.5.2血液學(xué)指標(biāo) 灌胃37 d后禁食12 h，麻醉各組大鼠，收集腹腔動(dòng)脈血1～2 mL，分離血清，按照各指標(biāo)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血糖、血尿素氮、血肌酐、總膽固醇、三酰甘油水平。

1.5.3腎組織病理形態(tài) 大鼠處死后，收集腎臟組織，稱重后一份用多聚甲醛固定，用于石蠟切片制備(HE染色、Masson染色)；一份用戊二醛固定用于電鏡檢測(cè)。①HE染色:取各組固定于多聚甲醛中的大鼠腎臟組織,進(jìn)行烤片、脫蠟、水化，蘇木素染色，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水中終止分化5 min，脫水，伊紅復(fù)染，透明，中性樹膠封片。②Masson染色：取各組固定于多聚甲醛中的大鼠腎臟組織,進(jìn)行烤片、脫蠟、水化，溫?zé)崴矗旧跋扔谜麴s水潤(rùn)濕玻片30～60 s；分別進(jìn)行R1核染液、R2漿染液染色，R3黃色分色液分色，棄去分色液后直接用R4藍(lán)色復(fù)染液染色5 min左右，倒丟，用無(wú)水乙醇沖洗干凈,中性樹膠封片。

1.5.4腎組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)情況 采用免疫組化法檢測(cè)：取制備好的腎臟組織石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、洗滌、一抗孵育、再洗滌、二抗孵育、再洗滌、滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液、再洗滌、顯色、終止染色、復(fù)染、自來(lái)水中反藍(lán)、脫水、透明、中性樹膠封片、37 ℃烤片過(guò)夜等操作后，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片按染色強(qiáng)度(0，1,2，3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)和陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分(無(wú)陽(yáng)性表達(dá)為0分，陽(yáng)性范圍 1%～25%為1分，陽(yáng)性范圍26%～50%為2分，陽(yáng)性范圍51%～75%為3分，陽(yáng)性范圍76%～100%為4分)，兩項(xiàng)評(píng)分分?jǐn)?shù)相乘即為IHC評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠尿蛋白定量比較 糖尿病腎病組和卡格列凈組注射鏈脲佐菌素第1～3天及灌胃37 d處死前1 d尿蛋白定量均明顯高于正常組(P均<0.05)，糖尿病腎病組和卡格列凈組注射鏈脲佐菌素第1～3天尿蛋白定量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，卡格列凈組灌胃37 d處死前1 d尿蛋白定量明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05)。 見(jiàn)圖1。

圖1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)尿蛋白定量

2.2各組大鼠血液學(xué)指標(biāo)比較 糖尿病腎病組大鼠血糖、BUN、Cr、TG、TC水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，卡格列凈組大鼠血糖、BUN、Cr、TG、TC水平均明顯低于糖尿病腎病組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠血糖、BUN、Cr、TG、TC水平比較

2.3各組大鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn) 正常組腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球及腎小管未見(jiàn)異常；糖尿病腎病組腎組織結(jié)構(gòu)稍紊亂，腎小球部分萎縮、部分增大，毛細(xì)血管狹窄，系膜基質(zhì)增生，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹或脫失；與糖尿病腎病組比較，卡格列凈組腎小球毛細(xì)血管狹窄、系膜基質(zhì)增生程度、腎小管上皮病變程度均較輕。見(jiàn)圖2。

圖2 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎臟組織HE染色光鏡下表現(xiàn)

2.4各組大鼠腎臟組織 Masson染色表現(xiàn) 正常組大鼠腎臟纖維組織增生不明顯，糖尿病腎病組大鼠腎小球及間質(zhì)明顯纖維化，卡格列凈組大鼠腎小球及間質(zhì)纖維化程度稍輕于糖尿病腎病組。見(jiàn)圖3。

圖3 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎臟組織Masson染色光鏡下表現(xiàn)

2.5各組大鼠腎臟組織電鏡下表現(xiàn) 正常組大鼠腎臟組織基底膜結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜及足突細(xì)胞完整,基底膜厚度為(0.154±0.013)nm；糖尿病腎病組大鼠腎臟組織毛細(xì)血管襻開放良好，內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯增生，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)輕度增生，系膜區(qū)輕度增寬，可見(jiàn)部分足突融合，基底膜厚度為(0.216±0.045)nm，明顯厚于正常組(P<0.05)；卡格列凈組大鼠的足突融合較糖尿病腎病組輕，基底膜厚度為(0.185±0.036)nm，明顯薄于糖尿病腎病組(P<0.05)。正常組、糖尿病腎病組、卡格列凈組足凸根部寬度分別為(0.196±0.043)nm、(0.230±0.039)nm、(0.202±0.030)nm,組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎臟組織電鏡下表現(xiàn)(×25 000)

2.6各組大鼠腎臟組織I型膠原蛋白表達(dá)情況 正常組腎組織中I型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)及弱，IHC評(píng)分為(1.333±0.516)分；糖尿病腎病組腎組織中I型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，IHC評(píng)分為(2.667±0.516)分，明顯高于正常組(P<0.05)；卡格列凈組腎組織中I型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)較糖尿病腎病組弱，IHC評(píng)分為(2.000±0.000)分，明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎臟組織中I型膠原蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色)

3 討 論

糖尿病腎病指糖尿病所致的慢性腎臟損害，臨床上以白蛋白尿和(或)腎小球?yàn)V過(guò)率下降持續(xù)超過(guò)3個(gè)月為主要特征[5]。高血糖環(huán)境引起的糖基化終末產(chǎn)物的增加以及血流動(dòng)力學(xué)的變化，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放，會(huì)引起腎小球超濾、腎小球高壓、腎肥大和腎小球組成改變，臨床表現(xiàn)為蛋白尿和高血壓，病理學(xué)上腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚和系膜區(qū)擴(kuò)張、腎臟發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)沉積(主要是系膜)、腎小球基底膜增厚、腎小管萎縮等多種改變，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[6]。既往研究表明，SGLT2的表達(dá)隨著腎小球高濾過(guò)的增加而增加，從而導(dǎo)致系膜擴(kuò)張，隨著纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的沉積，細(xì)胞外基質(zhì)增多，進(jìn)一步損害足細(xì)胞，加重腎小球硬化[7]。

SGLT2抑制劑可抑制腎小管對(duì)葡萄糖及鈉的重吸收，更多的鈉被輸送到致密斑，導(dǎo)致入球小動(dòng)脈擴(kuò)張，腎小球內(nèi)壓降低和高濾過(guò)減少，從而引發(fā)一系列正向的直接、間接或反饋性的連鎖反應(yīng)而呈現(xiàn)出的綜合效應(yīng)：促進(jìn)腎葡萄糖和鈉排泄，進(jìn)而降低機(jī)體代謝壓力、體重，降低血容量、血壓；改善心臟功能，減輕高葡萄糖導(dǎo)致的腎毒性(腎能量過(guò)度消耗、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、纖維化等)；減輕腎組織缺氧，恢復(fù)腎小管-小球反饋；緩解高濾過(guò)狀態(tài)并降低蛋白尿，促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生等[8-9]。Han等[10]研究表明，SGLT2抑制劑與噻唑烷二酮類藥物一起作用，可以通過(guò)減少1型細(xì)胞因子和血管緊張素原來(lái)減輕系膜擴(kuò)張。Nilsson等[11]發(fā)現(xiàn)SGLT2抑制劑即使在系膜細(xì)胞和足細(xì)胞中SGLT2表達(dá)較低時(shí)也能保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡，還可通過(guò)增加腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。Korbut等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在db/db小鼠中，SGLT2抑制劑單獨(dú)或與DPP-4抑制劑一起應(yīng)用可促進(jìn)腎小球自噬小體的形成。Wheeler等[13]報(bào)道，SGLT2抑制劑可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和腎小球內(nèi)炎癥，從而減輕腎纖維化。2022年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)制定的《糖尿病診療標(biāo)準(zhǔn)》指出，SGLT2抑制劑可獨(dú)立于血糖的機(jī)制降低腎小球囊內(nèi)壓及尿蛋白排泄并減緩腎小球?yàn)V過(guò)率的降低，且可抑制血管緊張素原的增加，減少超過(guò)50%的腎臟氧化應(yīng)激，可為糖尿病患者提供長(zhǎng)期的腎臟保護(hù)作用[14]。CREDENCE研究結(jié)果表明，SGLT2抑制劑可顯著降低腎臟事件的復(fù)合硬終點(diǎn)，抑制尿白蛋白排泄，降低終末期腎臟病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病腎病組和卡格列凈組處死前1 d尿蛋白定量和灌胃結(jié)束后血糖、BUN、Cr、TG、TC水平均明顯高于正常組，但卡格列凈組上述各指標(biāo)水平均明顯低于糖尿病腎病組；病理觀察顯示，糖尿病腎病組腎小球部分萎縮，毛細(xì)血管狹窄，系膜基質(zhì)增生，腎小球及間質(zhì)明顯纖維化，可見(jiàn)部分足突融合，基底膜增厚，卡格列凈組上述病理改變均較糖尿病腎病組輕；腎組織中I型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況顯示，糖尿病腎病組IHC評(píng)分明顯高于正常組，卡格列凈組明顯低于糖尿病腎病組。提示SGLT2抑制劑卡格列凈除了能降低血糖外，對(duì)糖尿病腎病還具有降脂、減少尿蛋白排泄、改善腎功能、減輕腎臟纖維化的作用，其抗腎臟纖維化的作用可能與其下調(diào)致纖維化因子I型膠原蛋白的表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果為糖尿病腎病的防治提供了新的靶點(diǎn)藥物，為SGLT2抑制劑的腎臟保護(hù)作用提供了更多基礎(chǔ)研究證據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。