黃小潔，劉 丹，孔冬妮，張 兵，吳華偉，薛 麒，楊 飛，侯力丹，薛青紅，李俊平*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081; 2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司；農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心，北京 100095)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)和禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV)同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，分別屬于γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬和α反轉(zhuǎn)錄病毒屬。這兩種病原有共同的致病特性，即均可引起腫瘤，小日齡感染容易產(chǎn)生免疫耐受，易引起長期的病毒血癥及造成免疫抑制等。臨床中常見REV與ALV共感染的報(bào)道[1-3]，而且這兩種病毒也是污染獸用生物制品的常見外源病毒，因此更加重了臨床中共感染的可能。目前市場上還沒有針對REV和ALV的商品化疫苗，由于這兩種病毒均不引起雞群明顯的死亡，因此二者對雞群的危害常常被養(yǎng)殖戶忽視。

近年來，有關(guān)ALV-J的報(bào)道較多，ALV-J與REV的共感染研究亦有大量報(bào)道，研究結(jié)果表明ALV-J與REV共感染對雞的致病性有明顯的協(xié)同作用[4-5]。2006年，在美國市場上使用的馬立克氏病疫苗中曾檢測出ALV-A污染；我國研究團(tuán)隊(duì)也在國內(nèi)市場上多個不同品種的雞胚或種雞中分離到了ALV-A[6-7]。與此同時(shí)，國內(nèi)外禽用疫苗中仍有污染REV的報(bào)道，所以有必要開展REV與ALV-A共感染研究。本實(shí)驗(yàn)通過人工感染的方式，使SPF雞單感染或共感染這兩種病毒，再進(jìn)行疫苗免疫，對實(shí)驗(yàn)雞的生長性能和免疫器官進(jìn)行檢測和比較分析，觀察REV與ALV-A單感染或者共感染后對疫苗免疫雞的生長性能和免疫器官的影響，以為其防治提供理論支撐和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病毒株 REV MD-2，分離自一污染的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒凍干活疫苗，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測一室鑒定保存；ALV-A毒株SDAU09C1株，分離自引進(jìn)的白羽肉用型祖代雞，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授饋贈。

1.2 細(xì)胞 雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，自北京梅里亞維通試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購入SPF雞胚，按《中華人民共和國獸藥典》附錄方法制備；DF1細(xì)胞，從美國菌種保藏中心(ATCC)購入。

1.3 疫苗 雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗(Fc-126株)，雞傳染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測一室制備檢定。雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(LaSota+H120株)，禽流感(H5+H9)二價(jià)活疫苗(H5 N1Re-5+H9 N2Re-2株)國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)；雞新城疫、傳染性支氣管炎、病毒性關(guān)節(jié)炎及傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗，國外企業(yè)生產(chǎn)。所有疫苗在進(jìn)行免疫之前測定病毒含量和外源病毒檢測。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物 所有SPF雞均購自北京梅里亞維通試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.5 1日齡SPF雞REV與ALV-A共感染對常規(guī)疫苗免疫雞群的影響 1日齡SPF雞175只，平均分成5組。1日齡時(shí)，REV單感染組、ALV-A單感染組、REV+ALV-A共感染組分別經(jīng)皮下注射REV MD-2病毒液0.2 mL(含500 TCID50)、ALV-A SDAU09C1病毒液0.2 mL(含500 TCID50)、REV MD-2和ALV-A SDAU09C1病毒混合液0.2 mL(各含250 TCID50)。疫苗免疫程序如下：1日齡時(shí)，各感染組和免疫對照組SPF雞每只經(jīng)頸部皮下注射雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗0.2 mL(含1羽份)；5日齡時(shí)，滴鼻接種新支二聯(lián)活疫苗0.1 mL(含1羽份)；10日齡時(shí)，滴眼免疫IBD活疫苗(B87株)0.1 mL(含1羽份)；17日齡時(shí)，皮下注射ND-IB-REO-IBD四聯(lián)滅活疫苗0.3 mL(含1羽份)；20日齡時(shí)，皮下注射禽流感(H5+H9)二價(jià)滅活疫苗0.3 mL(含1羽份)。同時(shí)設(shè)空白對照組，各時(shí)間段免疫均用生理鹽水代替。各組雞在5、10、15、20、25日齡時(shí)各取4只，每只稱重，并采集法氏囊、胸腺、脾臟稱重，其余雞繼續(xù)飼養(yǎng)。35、45、65日齡時(shí)全部雞稱重，75日齡稱重淘汰。

1.6 10日齡SPF雞REV與ALV-A共感染對常規(guī)疫苗免疫雞群的影響 選取1日齡SPF雞100只，分組和疫苗免疫程序同1.5項(xiàng)。REV單感染組雞于10日齡時(shí)皮下注射REV MD-2病毒液0.2 mL(含500 TCID50)，ALV-A單感染組雞于10日齡時(shí)每只經(jīng)皮下注射ALV-A SDAU09C1病毒液0.2 mL(含500 TCID50)，REV+ALV-A共感染組雞于10日齡時(shí)每只經(jīng)皮下注射REV MD-2和 ALV-A SDAU09C1病毒混合液 0.2 mL(各含250 TCID50)。每組雞于第5、10、20、25日齡時(shí)各取4只，逐只稱重并采集法氏囊、胸腺、脾臟稱重，剩余雞繼續(xù)飼養(yǎng)。35日齡、45日齡、65日齡時(shí)各組全部稱重，81日齡時(shí)稱重 后淘汰。

1.7 REV與ALV-A共感染對滅活疫苗免疫雞群的影響 1日齡SPF雞150只，平均分5組。1日齡時(shí)REV單感染組、ALV-A單感染組、REV、ALV-A共感染組注射與1.5項(xiàng)相同的病毒。滅活疫苗免疫程序如下：7日齡時(shí)，各感染組與免疫對照組雞經(jīng)頸部皮下注射ND-IB-REO-IBD四聯(lián)滅活疫苗0.3 mL(含1羽份)；14日齡時(shí)，頸部皮下注射禽流感(H5+H9)二價(jià)滅活疫苗0.3 mL(含1羽份)；空白對照在各免疫時(shí)段注射滅菌生理鹽水。各組雞在35日齡、65日齡、107日齡、131日齡稱重。

1.8 REV與ALV-A共感染對活疫苗免疫雞群的影響 1日齡SPF雞120只，平均分為4組，空白對照組和1.7項(xiàng)試驗(yàn)共用。1日齡時(shí)REV單感染組、ALV-A單感染組、REV+ALV-A共感染組注射與1.5項(xiàng)相同的病毒?；钜呙缑庖叱绦蛉缦拢?周齡時(shí)，滴鼻接種新支二聯(lián)活疫苗(La Sota株+H120株)0.1 mL(含1羽份)；2周齡時(shí)，滴眼免疫IBD活疫苗(B87株)0.1 mL(含1羽份)；7周齡滴鼻免疫新支二聯(lián)活疫苗(La Sota株+H52株)0.1 mL(含1羽份)。

1.9 數(shù)據(jù)處理 記錄每組試驗(yàn)雞發(fā)病和特異性死亡情況。以每次采樣各組體重的平均數(shù)分別繪制1.5項(xiàng)-1.8項(xiàng)試驗(yàn)中各組的體重增長曲線。免疫器官分別計(jì)算每只雞的法氏囊、胸腺、脾臟重量與體重的比值，然后通過t-test統(tǒng)計(jì)分析各采樣時(shí)間點(diǎn)各組間法氏囊比重、胸腺比重及脾臟比重的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 REV與 ALV-A共感染對免疫雞生長性能的影響

2.1.1 1日齡感染對常規(guī)免疫雞生長性能的影響共感染組特異性死亡5只，另4只明顯矮小，發(fā)病及死亡率為25.7%；REV單感染組特異性死亡3只，另5只明顯矮小，發(fā)病及死亡率為22.8%；ALV-A單感染組死亡2只，另2只體重明顯減輕，發(fā)病及死亡率為11.4%。體重分析結(jié)果見表1，感染組于20日齡開始，體重明顯低于免疫對照組，且共感染組體重下降更加明顯；在 35～75日齡間，REV單感染組和共感染組體重顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于免疫對照組與空白對照組。

表1 1日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的體重變化

Note：* Different capital letters at the right -top corner indicate extremely significant differences (P<0.01). Different small letters at the right-top corner indicate the significant differences (P<0.05). Different number of “*” at the top right corner indicate the significant differences (P<0.05). Same marker or no marker at the right -top corner indicate no significant differences (P>0.05)

2.1.2 10日齡感染對常規(guī)免疫雞生長性能的影響共感染組特異性死亡2只，另有4只癥狀明顯，病死率為20%；REV單感染組死亡2只，另2只發(fā)病，病死率為13.3%；ALV-A單感染組無死亡，有2只發(fā)病，發(fā)病率為6.7%。體重分析結(jié)果見表2，各感染組雞于35日齡時(shí)體重均顯著低于免疫對照組(P<0.05)，極顯著低于空白對照組(P<0.01)；45～81日齡，各感染組體重一直低于免疫對照組，但只有共感染組差異顯著(P<0.05)，與此同時(shí)，共感染組還低于各單感染組，但差異不顯著。這表明，10日齡雞REV與ALV-A單感染及共感染對雞生長性能有顯著影響，共感染的影響大于單感染。

表2 10日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的體重變化

2.1.3 1日齡感染對滅活疫苗免疫雞生長性能的影響 共感染組死亡9只，另2只矮小，病死率36.7%；REV單感染組死亡8只，另有1只矮小，病死率為30%；ALV-A單感染組死亡2只，另有1只瘦小，病死率為 10%；免疫對照意外死亡1只。體重分析見表3，整個試驗(yàn)期間，共感染組一直低于其他各組，35日齡、65日齡時(shí)分別顯著、極顯著低于ALV-A單感染組，試驗(yàn)期間一直與REV單感染組間無顯著性差異；REV單感染組于35日齡、65日齡時(shí)體重極顯著低于對照組(P<0.01)，之后仍一直低于對照組，但差異不顯著，65日齡時(shí)顯著低于ALV-A單感染組；ALV-A單感染組35日齡時(shí)極顯著低于對照組(P<0.01)，之后也一直低于對照組，但差異不顯著。

表3 1日齡REV與ALV-A單感染及共感染滅活疫苗免疫雞的體重變化

2.1.4 1日齡感染對活疫苗免疫雞生長性能的影響共感染組特異性死亡9只，另有1只矮小，病死率達(dá)33.3%；REV單感染組死7只，另有2只矮小，病死率為30%；ALV-A單感染組死亡2只，另有2只瘦小，病死率為13.3%。表4顯示，共感染組在35～107日齡時(shí)差異極顯著(P<0.01)低于其他各組，131日齡時(shí)差異顯著(P<0.05)低于對照組和ALV-A單感染組，三個感染組在65～107日齡時(shí)差異極顯著(P<0.01)兩個對照組，而且共感染組在35日齡、65日齡時(shí)還極顯著低于兩個單感染組(P<0.01)，而兩個單感染組在整個試驗(yàn)期間都差異不顯著。

表4 1日齡REV與ALV-A單感染及共感染活疫苗免疫雞的體重變化

2.2 REV與ALV-A共感染對免疫雞免疫器官比重的影響

2.2.1 對胸腺比重的影響 1日齡雞單感染或共感染 REV與ALV-A后，常規(guī)疫苗免疫，對雞胸腺比重的影響(表5)，REV單感染組在20～45日齡顯著低于兩個對照組和ALV-A單感染組(P<0.05)，但差異不顯著；共感染組在 20～45日齡一直極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)低于其他組，并在 20～45日齡高于REV 單感染組，但差異不顯著；且在25～45日齡顯著低于 ALV-A單感染組(P<0.05)，并低于共感染組，但差異不顯著；ALV-A單感染組與對照組間無顯著性差異，對胸腺比重的影響不顯著。

表5 1日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的胸腺比重變化

10日齡雞單感染或共感染REV與ALV-A，常規(guī)疫苗免疫，其胸腺比重分析結(jié)果(表6)顯示，在整個試驗(yàn)期間所有組間均差異不顯著。有ALV-A單感染組顯著高于空白對照組，其余各組間差異均不顯著。

表6 10日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的胸腺比重變化

2.2.2 對法氏囊比重的影響 1日齡雞感染后(表7)，10日齡開始，三個感染組和免疫對照組一直低于空白對照組，在20日齡時(shí)REV單感染組和共感染組顯著低于空白對照組(P<0.05)，25日齡時(shí)其他各組均極顯著低于空白對照組(P<0.01)，45日齡時(shí)，REV單感染組和共感染組極顯著低于空白對照組(P<0.01)，顯著低于免疫對照組及ALV-A單感染組(P<0.05)。試驗(yàn)過程中，ALV-A單感染組與免疫對照組間一直無顯著性差異。

表7 1日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的法氏囊比重變化

10日齡雞感染后(表8)，35日齡檢測時(shí)，三個感染組均極顯著低于空白對照組(P<0.01)，免疫對照組顯著低于空白對照組(P<0.05)，各感染組低于免疫對照組，但差異不顯著，ALV-A單感染組略高于REV單感染組和共感染組；45日齡時(shí)，REV單感染組和共感染組極顯著低于空白對照組(P<0.01)，顯著低于免疫對照組(P<0.05)。ALV-A組法氏囊比重與其他各組均無顯著性差異，REV單感染組與共感染組間亦無顯著性差異。

表8 10日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的法氏囊比重變化

2.2.3 對脾臟比重的影響 1日齡雞感染時(shí)脾臟比重分析結(jié)果(表9)顯示，各感染組和免疫對照組在5日齡時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，10日齡時(shí)極顯著高于空白對照組(P<0.01)；20日齡時(shí)共感染組和免疫對照組極顯著高于空白對照組(P<0.01)，REV單感染組和ALV-A單感染組顯著高于空白對照組(P<0.05)。

表9 1日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的脾臟比重變化

10日齡雞感染時(shí)，脾臟比重分析結(jié)果(表10)顯示，各感染組和免疫對照組都極顯著高于空白對照組(P<0.01)，且各組間無顯著性差異；在35日齡時(shí)，僅ALV-A單感染組顯著高于空白對照組(P<0.05)，其他各組間均差異不顯著，45日齡時(shí)各組間差異都不顯著。

表10 10日齡REV與ALV-A單感染及共感染常規(guī)免疫雞的脾臟比重變化

3 討 論

REV和ALV是雞群中常見的兩種可以垂直傳播的免疫抑制性病毒，其單獨(dú)感染或者共同感染后導(dǎo)致的免疫抑制問題一直備受關(guān)注，由此造成的疫苗免疫失敗給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。免疫器官是動物執(zhí)行免疫功能的組織機(jī)構(gòu)，它們的發(fā)育狀況直接影響到機(jī)體免疫力的高低[8]。免疫抑制是指由于各種因素作用，使機(jī)體對抗原的應(yīng)答能力低下甚至喪失的現(xiàn)象[9]。REV本身對禽的致死力不明顯，但其能夠損害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使機(jī)體的免疫功能下降，從而易遭受其他病原的侵襲[10]。有研究表明，REV與ALV-J共感染在致病性方面有明顯的協(xié)同作用，可引起體重下降、免疫器官損傷嚴(yán)重等情況[11]。而REV與ALV-A共感染對免疫雞群的影響，一直缺乏系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)。本研究在有免疫刺激的情況下，探討REV與ALV-A共感染對雞生長發(fā)育、免疫器官等方面的影響。

本研究表明，在常規(guī)免疫、滅活疫苗及活疫苗免疫三種免疫情況下，無論是1日齡雞還是10日齡雞單感染REV或共感染REV和ALV-A均會引起發(fā)病和死亡，而且嚴(yán)重程度高于非免疫情況。疫苗免疫會加重 REV與ALV-A感染，感染日齡越小對感染的敏感性越高，而且共感染有明顯的協(xié)同致病作用。REV與ALV-A 單感染或共感染對體重的影響更加明顯，常規(guī)免疫可在短期內(nèi)(65日齡前)引起雞只體重明顯下降。其中REV單感染和與ALV-A共感染對體重下降的影響明顯較ALV-A 單感染嚴(yán)重，下降幅度更大，持續(xù)時(shí)間也較長。此外本研究還表明，在病毒感染的情況下，活疫苗免疫引起的雞體重下降比滅活疫苗免疫更加嚴(yán)重。

1日齡感染時(shí)，無論是REV單感染還是共感染都會引起胸腺比重的下降，免疫對照組和ALV-A單感染組與空白對照組差異不顯著。10日齡感染時(shí)，所有組與空白對照組的差異均不顯著，這表明雞日齡越大受感染后對胸腺的影響越小。常規(guī)疫苗免疫時(shí)法氏囊比重顯著或極顯著低于空白對照組，原因是10日齡時(shí)免疫雞法氏囊病活疫苗(B87株)，活疫苗刺激加重了法氏囊的萎縮，之后該組法氏囊比重與空白對照組差距逐漸縮小，說明正常免疫造成的萎縮可以在一定程度上恢復(fù)。1日齡雞 REV 單感染或共感染加重了法氏囊比重的下降，20日齡時(shí)REV單感染組和共感染組法氏囊比重開始低于其他組，20日齡以后顯著或極顯著低于其他三組，說明REV感染對法式囊的損傷持久且不可恢復(fù)，ALV-A 單感染對法氏囊損傷的影響不明顯。與 1日齡 REV 單感染及共感染對法氏囊比重的影響相比，10日齡感染造成的影響相對較小。感染或常規(guī)免疫可引起脾臟比重非特異性增高，免疫對照組和REV單感染組對脾臟比重的影響沒有ALV-A單感染和共感染組大。疫苗免疫或感染均引起脾臟比重的升高，REV 與 ALV-A 單感染和共感染與免疫對照組間無顯著性差異。

綜上研究表明，REV、ALV-A單感染或共感染都會引起生長發(fā)育遲緩，消瘦，引起胸腺、法氏囊的萎縮，脾臟的腫大，而且REV單感染或共感染對這些的影響遠(yuǎn)大于ALV-A的影響，尤其是在疫苗免疫的情況下影響更重?？梢钥闯鯮EV感染造成的癥狀、病理損傷和免疫抑制現(xiàn)象更為顯著，在共感染或是疫苗免疫情況下對雞群的傷害更大。陳瑞愛做過REV和ALV-J對雞獲得性免疫影響的研究，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)基本一致[12]。由此可見，在活疫苗生產(chǎn)中如果疫苗污染了REV等外源病毒，對雞群造成的影響甚至比單一感染更嚴(yán)重。因此，嚴(yán)格把控外源病毒污染是活疫苗生產(chǎn)過程中必須高度重視的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究REV和ALV-A單感染或者共感染誘導(dǎo)雞群發(fā)生免疫抑制機(jī)制提供了新的數(shù)據(jù)。