沈 昕，張玉潔，黃耀凌，李 丹，張 驪，孫紅洋，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 10081)

莫昔克丁，也稱莫西菌素，是一種安全、長效的殺蟲藥，在日本、歐洲等多個國家登記，并作為對環(huán)境友好的殺蟲劑被美國環(huán)保局推薦使用[1]。研究表明，莫昔克丁能殺滅盤尾絲蟲的微絲蚴，還可通過抑制成蟲體內(nèi)的胚胎發(fā)育和微絲蚴的釋放發(fā)揮其作用，同時不同程度的降低各成長階段盤尾絲蟲的蠕動、成蟲的繁殖能力以及免疫調(diào)節(jié)蛋白的分泌[2-3]。自20世紀(jì)80年代中期以來，莫昔克丁也被作為驅(qū)蟲藥廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中[4]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，莫昔克丁對牛、羊、豬體內(nèi)的消化道線蟲、肺線蟲和體外寄生蟲都具有良好的驅(qū)殺作用，其與吡蟲啉的混合制劑可用于治療犬、貓的線蟲病、螨蟲病及鉤端螺旋體炎，同時也能在禽類體內(nèi)保持高效的驅(qū)蟲活性[5-18]。2014年，吡蟲啉莫昔克丁滴劑(貓用、狗用)被批準(zhǔn)在國內(nèi)上市，同年，由浙江海正藥業(yè)股份有限公司研發(fā)的二類新藥莫昔克丁及莫昔克丁澆潑溶液在國內(nèi)獲批上市。

莫昔克丁為第三代阿維菌素類藥物，具有很高的親脂性，在脂肪中分布極高，糞便為其主要排泄途徑，且主要殘留形式為莫昔克丁原藥[14]。我國GB-31650-2019規(guī)定莫昔克丁在牛肌肉中的最大殘留限量(maximum residue limit, MRL)為 20 μg/kg，在綿羊肌肉中的MRL為50 μg/kg，在牛、綿羊的脂肪、肝及腎中的MRL分別為500 μg/kg、100 μg/kg和50 μg/kg[19]。目前，我國尚無動物組織中莫昔克丁殘留檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，且同時針對多種動物組織中莫昔克丁的殘留方法的報道也較少[21-23]。本研究擬建立一種適用于牛、羊組織樣品中莫昔克丁殘留檢測的高效液相色譜方法，以滿足當(dāng)前的實驗室檢測需求，同時為動物食品安全檢測提供有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥94%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；、乙腈、甲醇均為色譜純，三乙胺、三氟乙酸酐、冰醋酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；N-甲基咪唑，上海麥克林生化科技有限公司；水為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(1260，配熒光檢測器)，美國Agilent公司；分析天平(XS105DU)，電子天平(AE260)，Mettler Toledo公司；Biofuge stratos離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；渦旋混合器(MS3)，振蕩器(ks 501 digital)，德國IKA公司；氮吹儀(FV64)，得泰儀器公司；鼓風(fēng)干燥箱(LC-213)，上海愛斯佩克環(huán)境儀器有限公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司；C18固相萃取柱，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)品純度折算后，精密稱定10.0 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；準(zhǔn)確吸取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，成為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，密封貯存于-20 ℃冰箱。

精密量取莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，分別用乙腈逐級稀釋，制成濃度為4、10、100、500、1000和2000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。以上6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL于10 mL試管中，50 ℃水浴下氮氣吹干后，進(jìn)行衍生化，加入甲醇，上機檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.2 衍生化試劑的配制 分別以N-甲基咪唑-乙腈(1+1，V/V)和三氟乙酸酐-乙腈(1+2，V/V)作為衍生化試劑A液、B液，并保證臨用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取 稱取均質(zhì)后的牛、羊的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟組織各(2±0.02) g置于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋混勻后中速振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中。按照上述步驟再提取一次，將兩次上清液合并，加入5 mL水，渦旋混勻后，加入三乙胺20 μL(羊肝臟加三乙胺50 μL)，混勻備用。

1.3.2.2 凈化 依次用5 mL乙腈和5 mL 30%乙腈水溶液活化C18固相萃取柱，將上述備用液全部過柱后，用5 mL 30%乙腈水溶液淋洗，用5 mL乙腈洗脫萃取柱。將洗脫液收集于10 mL具塞試管中，50 ℃水浴氮氣吹干。

1.3.2.3 衍生化 依次向吹干后殘渣中加入100 μL衍生化試劑A液和150 μL衍生化試劑B液，密閉渦動10 s后，加入50 μL冰醋酸和三乙胺各50 μL，漩渦混勻10 s，65 ℃下，避光密閉反應(yīng)15 min。反應(yīng)完成冷卻后，加入650 μL甲醇，混勻后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜檢測。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenonx luna C18250 mm × 4.6 mm(i.d), 粒徑5 μm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動相：乙腈+水(90+10，V/V)；流速：1.8 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長475 nm。

1.4 方法靈敏度的確定 分別在北京市內(nèi)購置的不同品牌及廠家的牛及羊的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟進(jìn)行篩選，所得空白樣品進(jìn)行添加回收試驗，按照上述樣品前處理方法處理，進(jìn)HPLC 分析，測得藥物色譜保留處的基線噪音值，求其平均值。以S /N≥3作為該方法藥物的檢測限；以S /N≥10，且在該添加水平的回收率和變異系數(shù)均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(LOQ)。

1.5 準(zhǔn)確度和精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛及羊的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟組織中分別添加定量限、1/2 MRL、MRL和2 MRL四個濃度的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行回收率試驗，各濃度進(jìn)行5個樣品平行試驗，同時重復(fù)3次空白試驗，求每個樣品的回收率和批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍與檢測限和定量限 配制濃度分別為4、10、100、500、1000和2000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.3.2項步驟處理，上機檢測，得到莫昔克丁在6個濃度水平下的線性回歸方程為y=0.3412x-3.2242，其相關(guān)系數(shù)大于等于0.9996，線性范圍較好。依據(jù)信噪比S/N ≥3和S/N ≥10(按PtP計算)，確定檢出限(LOD)及定量限(LOQ)分別為2 μg/kg和5 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)對照液、空白牛、羊肝臟及添加標(biāo)樣中的高效液相色譜圖見圖1～圖2。

圖1 莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(10 ng/mL)

圖2 空白牛肝臟試樣色譜圖A；空白羊肝臟試樣色譜圖B；牛肝臟添加莫昔克丁試樣色譜圖(5 μg/kg)C ；羊肝臟添加莫昔克丁試樣色譜圖(5 μg/kg)D

2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 本方法分別選用由北京本地市場和網(wǎng)上購買的樣品進(jìn)行空白樣品篩選。分別在8種不同空白樣品中添加其相對應(yīng)的定量限、1/2 MRL、MRL和2 MRL水平濃度后進(jìn)行測定，其中牛肌肉分別添加5、10、20、40 ng/g水平濃度，牛、羊肝臟分別添加5、50、100、200 ng/g水平濃度，牛腎臟、羊肌肉、羊腎臟分別添加5、25、50、100 ng/g水平濃度，牛脂肪、羊脂肪分別添加5、250、500、1000 ng/g水平濃度，每個水平濃度做5個平行樣品，并重復(fù)3次實驗，計算其批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1～表8。

表1 牛肌肉中莫昔克丁添加回收率

表2 牛肝臟中莫昔克丁添加的回收率

表3 牛腎臟中莫昔克丁添加的回收率

表4 牛脂肪中莫昔克丁添加的回收率

表5 羊肌肉中莫昔克丁添加的回收率

表6 羊肝臟中莫昔克丁添加的回收率

表7 羊腎臟中莫昔克丁添加的回收率

表8 羊脂肪中莫昔克丁添加的回收率

結(jié)果顯示，莫昔克丁在牛肌肉的添加回收率為71.8%～103%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10.6%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤7.55%；對羊肌肉、腎臟，牛腎臟的添加回收率均在82.8%～110%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤7.29%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤7.95%；對牛肝臟、羊肝臟的添加回收率均在74.7%～108%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8.15%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤9.04%；對牛、羊脂肪的添加回收率均在60.5%～ 87.3%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15.8%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8.50%。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取條件的優(yōu)化 莫昔克丁易溶于多種有機溶劑[16-18]，本方法分別對乙酸乙酯、20%乙醇乙腈、乙腈的提取效果比較時發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取回收率較低，20%乙醇乙腈和乙腈提取回收率均能達(dá)到80%以上，但經(jīng)比較分析，20%乙醇乙腈提取后，藥物峰形變寬，因此，本方法選擇乙腈作為提取溶劑，并通過高速離心去除蛋白質(zhì)等大量雜質(zhì)的干擾，有效提取其中的待測藥物。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，提取液中加入適量三乙胺可降低基質(zhì)雜質(zhì)的影響，但加入過多三乙胺會影響藥物的回收率，因此，本方法經(jīng)過向不同組織中分別添加不同量的三乙胺，最終確定合適添加量為20 μL，但羊肝臟中需添加50 μL，可達(dá)到較好效果(圖3)。

圖3 提取溶劑對回收率的影響(羊肝臟)

3.2 凈化條件的優(yōu)化 由于莫昔克丁具有很高的親脂性[17-18]，同時，動物肌肉及內(nèi)臟中含有豐富的脂肪，因此，本試驗未選用正己烷等有機溶劑進(jìn)行除脂。通過參考阿維菌素類藥物凈化方法的文獻(xiàn)[20-26]，試驗分別選取HLB柱和C18柱進(jìn)行凈化比較。試驗發(fā)現(xiàn)，雖然2種固相萃取柱回收率與穩(wěn)定性均較好，但HLB柱過濾后的溶液雜質(zhì)較多，C18柱的凈化效果更好，且在去除蛋白、脂肪等雜質(zhì)方面更有優(yōu)勢，故本方法選用C18柱作為凈化固相萃取柱。在淋洗試劑的選用上，大部分阿維菌素類藥物使用異辛烷或正己烷淋洗進(jìn)一步除脂[20-25]，考慮到莫昔克丁的脂溶性較強，本試驗選用乙腈和30%乙腈水溶液活化C18柱，并用30%乙腈水溶液進(jìn)行淋洗，在進(jìn)一步有效去除雜質(zhì)的同時，保證了藥物的回收率(圖4)。

圖4 提取溶劑對雜質(zhì)的影響(羊肝臟)

3.3 衍生化條件的優(yōu)化 阿維菌素類藥物衍生化試劑的選用，普遍使用A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，V/V)和B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，V/V)[24-26]。本試驗分別對衍生化的溫度、時間、光照條件進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)若在室溫下進(jìn)行，則衍生化時間較長，若在加熱條件下進(jìn)行，衍生化速度快且充分。在反應(yīng)溫度和時間一定的前提下，在光照和避光兩種條件下，前者藥物的峰面積均明顯低于后者。在衍生化試劑的選擇上，本試驗分別選用了不同品牌的試劑進(jìn)行比對，試驗發(fā)現(xiàn)，國藥品牌與麥克林品牌N-甲基咪唑均適用于本試驗，且回收率結(jié)果基本一致，但分別選用國藥品牌與TCI品牌三氟乙酸酐進(jìn)行衍生化后，在檢測結(jié)果信噪比相同的情況下，選用TCI品牌三氟乙酸酐衍生化的樣品峰高明顯低于國藥品牌。故本試驗選用國藥品牌試劑，在避光、65 ℃條件下反應(yīng)15 min作為衍生化條件，并將衍生產(chǎn)物與甲醇混合形成醇式衍生物，具有較好穩(wěn)定性，4 ℃保存24 h后進(jìn)樣，測得藥物峰面積基本不變。

3.4 組織適用性的優(yōu)化 莫昔克丁為第三代阿維菌素類藥物，目前文獻(xiàn)報道中尚且沒有一種方法能同時應(yīng)用于多種動物組織中莫昔克丁的殘留檢測[21-23]。本研究為了更好的適應(yīng)我國現(xiàn)階段食品安全監(jiān)測工作需要，完善相應(yīng)藥物檢測方法，利用現(xiàn)有檢測技術(shù)手段，通過對樣品的提取、凈化、衍生化等條件的優(yōu)化，建立了可同時適用于牛、羊的肌肉、脂肪、肝臟及腎臟樣品中莫昔克丁的殘留檢測方法，進(jìn)一步完善了我國獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)體系。

本試驗建立了一種適用于牛、羊肌肉、肝臟、腎臟、脂肪等多種組織中莫昔克丁的高效液相色譜法。該方法操作簡單、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、成本低，適用于莫昔克丁的分析檢測。本方法的建立，進(jìn)一步完善了我國獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)體系，為食品安全檢測提供了有效技術(shù)手段。