郭培紅，田丹陽(yáng)，黃 健，孫丙耀，宋學(xué)宏*

(1. 昆山貝瑞康生物科技有限公司，江蘇昆山 215345；2. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123)

卵黃抗體又稱卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)，是雞血清IgG轉(zhuǎn)移到卵黃中形成的特異性抗體。常見(jiàn)的IgY提取方法有凍融法、水稀釋法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、天然膠法、去污劑提取法等[1-5]，但這些方法存在工藝流程多、設(shè)備要求高、試劑用量大、化學(xué)物質(zhì)殘留、污染環(huán)境等弊端。

碳點(diǎn)(carbon dots)是一種近似球形的直徑小于10 nm的零維半導(dǎo)體納米晶體，是極少分子或者原子組成的納米團(tuán)簇，其表面存在羥基、羧基、羰基等多種含氧官能團(tuán)[6-7]，具有水溶性好、易功能化、低毒性和生物相容性強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于不同生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[8～10]。碳點(diǎn)表面存在多種含氧官能團(tuán)，這一特性能否促進(jìn)卵黃中蛋白質(zhì)聚合體的解聚或脂蛋白中脂肪的去除，從而提高IgY的提取效率，有待驗(yàn)證。旨在分析維生素C碳點(diǎn)對(duì)IgY提取效果的影響，從而為規(guī)?；崛gY的可行性以及碳點(diǎn)的創(chuàng)新性應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 抗草魚(yú)IL-1β高免蛋：選擇蘇州市吳江區(qū)汾湖鎮(zhèn)紅興禽蛋經(jīng)營(yíng)部130日齡健康產(chǎn)蛋雞，按照既定流程免疫，收集高免蛋[11]；維生素C碳點(diǎn)由蘇州大學(xué)功能納米與軟物質(zhì)研究院前期制備，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑及儀器 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；HRP標(biāo)記羊抗雞IgY抗體購(gòu)自Thermo Fisher公司；鄰苯二胺購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。CR22G型高速冷凍離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品，J-815圓二色光譜儀為日本Jasco公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀是美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品，其他均為國(guó)產(chǎn)儀器。

1.2 方法

1.2.1 IgY提取方法 常溫下用自來(lái)水清洗抗草魚(yú)IL-1β高免雞蛋，接著用0.25 mg·L-1的二氧化氯水溶液浸泡消毒5 min。用卵黃分離器獲取卵黃，室溫?cái)嚢杈鶆虻玫交旌下腰S液。將維生素C碳點(diǎn)溶入濃度為0.12 mol·L-1(pH 5.1)的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，獲得濃度分別為0.00、6.25、12.50及25.00 mg·L-1的維生素C碳點(diǎn)溶液。取卵黃液，按照卵黃與緩沖液體積比分別為1∶5、1∶7和1∶9的比例，加入含不同濃度維生素C碳點(diǎn)的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，室溫100 r·min-1混合10 min，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，其中3個(gè)室溫下，另2個(gè)4 ℃下避光靜置沉淀15 h。最后，室溫條件下4000 r·min-1離心30 min得上清，即為抗草魚(yú)IL-1β IgY提取液，留樣待測(cè)。同樣方法制備普通雞蛋IgY提取液。

1.2.2 IgY二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色光譜分析 卵黃與緩沖液體積比為1∶9組的不同濃度維生素C碳點(diǎn)提取的IgY提取液，經(jīng)定性濾紙過(guò)濾除脂，然后加入硫酸銨晶體，使其終濃度為19%，室溫靜置1 h后，12000 r·min-1低溫離心10 min，得白色沉淀。將白色沉淀溶解于原體積的PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.4)中，再加入硫酸銨晶體至終濃度13%，室溫靜置1 h后12000 r·min-1低溫離心10 min，取其白色沉淀，溶于PBS。4 ℃條件下，PBS中攪拌透析24 h，期間更換4次PBS，最終得到純化的抗草魚(yú)IL-1β IgY。調(diào)整各組IgY終濃度至0.2 g·L-1，在J-815圓二色光譜儀上測(cè)定IgY二級(jí)結(jié)構(gòu)。測(cè)定參數(shù)：石英樣品池光徑1 mm，靈敏度20 mdeg，掃描速度100 nm·min-1，掃描范圍190～250 nm，室溫下進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)中以PBS緩沖液為空白扣除溶劑吸收峰，所有圓二色數(shù)據(jù)經(jīng)3次掃描取平均值，得圓二色譜圖。所得圓二色數(shù)據(jù)經(jīng)儀器自帶分析軟件，采用楊氏算法擬合并計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)比例。

1.2.3 IgY提取液中蛋白含量的測(cè)定 采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定IgY提取液中水溶性蛋白含量。

1.2.4 IgY提取液中IgY量的直觀測(cè)定 因IgY提取液中殘存少量雜蛋白，為進(jìn)一步直觀檢測(cè)不同濃度維生素C碳點(diǎn)對(duì)IgY提取效果的影響，將IgY提取液用定性濾紙過(guò)濾，用質(zhì)量體積比為19%的硫酸銨晶體進(jìn)行沉淀后，再用IgY提取液相同體積的PBS重懸，取20 μL重懸液上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，鑒定IgY提取效果。

1.2.5 IgY提取液中抗體效價(jià)的測(cè)定 IgY提取液中抗體效價(jià)采用間接ELISA法測(cè)定：用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 9.6)稀釋純化的抗草魚(yú)IL-1β重組蛋白至3 mg·L-1，包被96孔酶標(biāo)板，37 ℃溫育1.5 h后于4 ℃過(guò)夜，10%脫脂牛奶37 ℃封閉處理2 h；用抗體稀釋液(含1%脫脂牛奶的PBS)將IgY提取液按不同倍數(shù)稀釋待檢；二抗為羊抗雞辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體(1∶2500稀釋)；鄰苯二胺為顯色底物；2 mol·L-1的H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在492 nm處讀取OD值。以相同條件提取的普通雞蛋的IgY作為陰性對(duì)照，抗體稀釋液為空白對(duì)照。判定標(biāo)準(zhǔn)為：P/N =(待測(cè)OD值-空白對(duì)照OD值)/(陰性對(duì)照OD值-空白對(duì)照OD值)，當(dāng)P/N ≥ 2.1時(shí)抗體最大稀釋度即為抗體效價(jià)。

1.2.6 IgY提取液中細(xì)菌含量測(cè)定 以4 ℃條件下提取的IgY提取液為對(duì)照，用LB固體平板涂布，測(cè)定當(dāng)卵黃與緩沖液體積比為1∶9時(shí)不同濃度的維生素C碳點(diǎn)處理的草魚(yú)IL-1β IgY提取液中總菌含量。為驗(yàn)證維生素C碳點(diǎn)的殺菌作用，并排除離心對(duì)IgY提取液中菌含量的影響，將IgY提取液與卵黃中原有脂肪沉淀混合后，分別取100 μL涂布，培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，采用SPSS17.0經(jīng)One-way NOVA分析后進(jìn)行Duncan's多重比較法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性，顯著水平為P< 0.05；用OriginPro 9.0軟件和Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C碳點(diǎn)對(duì)IgY二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)多肽鏈中有規(guī)則的重復(fù)的構(gòu)象，其穩(wěn)定性是通過(guò)肽鏈骨架上的羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維系，α-螺旋存在很多氫鍵，是蛋白質(zhì)中最常見(jiàn)、最典型、含量最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件[12]。α-螺旋的圓二色譜在極值波長(zhǎng)191 nm處呈正峰，在207～210 nm處及221～222 nm處呈負(fù)峰。不同濃度維生素C碳點(diǎn)提取的抗草魚(yú)IL-1β IgY的圓二色光譜分析結(jié)果見(jiàn)圖1。光譜結(jié)果經(jīng)軟件分析可知，抗草魚(yú)IL-1β IgY是一個(gè)典型的只具有α-螺旋和β轉(zhuǎn)角的蛋白，其中α-螺旋相對(duì)含量50%以上，這與方希修等[13]的研究結(jié)果略有差異，可能跟不同儀器的靈敏度及計(jì)算方法不同有關(guān)。隨著維生素C碳點(diǎn)的添加，IgY二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量呈現(xiàn)先增加后減低的趨勢(shì)，其中6.25及12.50 mg·L-1組的α-螺旋相對(duì)含量為59.0%和55.5%，分別較對(duì)照組提高了12.6%和5.8%，25.00 mg·L-1組的α-螺旋相對(duì)含量與對(duì)照組完全一致，分別為52.2%和52.4%。結(jié)果證明維生素C碳點(diǎn)有提高抗草魚(yú)IL-1β IgY結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。

圖1 不同濃度維生素C碳點(diǎn)提取的抗草魚(yú)IL-1β IgY的圓二色光譜圖譜

2.2 維生素C碳點(diǎn)對(duì)高免蛋卵黃中水溶性蛋白的提取效果的影響 抗草魚(yú)IL-1β IgY提取液中水溶性蛋白含量結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，緩沖溶液不同稀釋比例組IgY提取液中水溶性蛋白濃度隨維生素C碳點(diǎn)濃度的增加而提高。各組間綜合比較，當(dāng)維生素C碳點(diǎn)濃度為25.00 mg·L-1時(shí)，緩沖液比例為1∶9組的IgY提取效果最好，達(dá)到極顯著性差異(P<0.01)，其次是緩沖液比例為1∶7組(P<0.05)。緩沖溶液稀釋比例越高，可溶性蛋白提取效果越好,添加維生素C碳點(diǎn)有助于卵黃中水溶性蛋白的提取。

表1 不同濃度維生素C碳點(diǎn)及不同比例的緩沖液提取卵黃中水溶性蛋白的效率(mg·g-1卵黃)

2.3 維生素C碳點(diǎn)對(duì)IgY提取液中IgY量的直觀影響 SDS-PAGE電泳分析了維生素C碳點(diǎn)添加對(duì)IgY提取效果的影響，其結(jié)果如圖2。由圖2可知，抗草魚(yú)IL-1β IgY SDS-PAGE電泳圖可觀察到66 kDa左右的IgY重鏈、25 kDa左右的IgY輕鏈，以及40 kDa上下的兩條雜蛋白條帶(可能是卵黃蛋白原Ⅱ前體的C-末端片段[14])。從純度(即條帶灰度)分析，相同緩沖溶液比例組，當(dāng)維生素C碳點(diǎn)濃度為6.25 mg·L-1時(shí)抗體提取效果最好，其次為12.50 mg·L-1濃度組，其它組差異不明顯；三個(gè)比例的緩沖液提取的IgY均能達(dá)到較高純度，且差異不明顯。此結(jié)果與卵黃抗體提取液中水溶性蛋白含量結(jié)果不一致，說(shuō)明高濃度維生素C碳點(diǎn)在提取IgY的同時(shí)提高了部分非IgY的水溶性雜蛋白，低濃度維生素C碳點(diǎn)更有利于IgY的提取。

注：M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1～3，維生素C碳點(diǎn)濃度為0.00 mg·L-1；泳道4～6，維生素C碳點(diǎn)濃度為6.25 mg·L-1；泳道7～9，維生素C碳點(diǎn)濃度為12.50 mg·L-1；泳道10～12，維生素C碳點(diǎn)濃度為25.00 mg·L-1。泳道1、4、7、10，卵黃與緩沖液質(zhì)量體積比為15；泳道2、5、8、11，卵黃與緩沖液質(zhì)量體積比為1∶7；泳道3、6、9、12，卵黃與緩沖液質(zhì)量體積比為1∶9。

2.4 維生素C碳點(diǎn)對(duì)IgY提取液中抗體效價(jià)的影響 將室溫條件下，同一緩沖溶液體積比的相同維生素C碳點(diǎn)濃度的三個(gè)重復(fù)IgY提取液合并后測(cè)其抗體效價(jià)，結(jié)果如圖3。由圖3中ELISA結(jié)果可知，當(dāng)卵黃與緩沖溶液比例為1∶5時(shí)，乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中添加維生素C碳點(diǎn)后各組IgY提取液中抗體效價(jià)均由對(duì)照組的1∶16 000提高到了1∶32000；當(dāng)卵黃與緩沖溶液比例為1∶7時(shí)，維生素C碳點(diǎn)濃度6.25及12.50 mg·L-1組的抗體效價(jià)由1∶16000提高到了1∶32000，但維生素C碳點(diǎn)濃度25.00 mg·L-1組的抗體效價(jià)與未添加維生素C碳點(diǎn)組無(wú)差異；當(dāng)卵黃與緩沖溶液比例為1∶9時(shí)，對(duì)照組抗體效價(jià)為1∶8000，維生素C碳點(diǎn)濃度25.00 mg·L-1組的抗體效價(jià)為1∶16000，而維生素C碳點(diǎn)濃度6.25及12.50 mg·L-1組的抗體效價(jià)達(dá)到了1∶32000。此結(jié)果一方面說(shuō)明維生素C碳點(diǎn)的添加有助于IgY的提取，另一方面說(shuō)明低濃度維生素C碳點(diǎn)提取IgY的效果較好。

圖3 不同濃度維生素C碳點(diǎn)及不同比例緩沖液提取的卵黃抗體的抗體效價(jià)

2.5 維生素C碳點(diǎn)對(duì)IgY提取液中細(xì)菌含量的影響 當(dāng)卵黃與緩沖液體積比為1∶9時(shí)不同濃度的維生素C碳點(diǎn)對(duì)抗草魚(yú)IL-1β IgY提取液中總菌含量的影，室溫條件下，未添加維生素C碳點(diǎn)的緩沖液提取的IgY液中細(xì)菌量較低溫條件菌含量高(P<0.05)；當(dāng)緩沖液中加入維生素C碳點(diǎn)后IgY提取液中的細(xì)菌含量顯著下降(P<0.05)，且菌落數(shù)隨維生素C碳點(diǎn)濃度的提高而減少，直至完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。說(shuō)明在添加一定濃度維生素C碳點(diǎn)的情況下，可以實(shí)現(xiàn)室溫提取IgY，且因維生素C碳點(diǎn)會(huì)降解而無(wú)毒，使得提取IgY后的副產(chǎn)品可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

3 討 論

IgY穩(wěn)定性好，可室溫長(zhǎng)期保存，能夠有效通過(guò)動(dòng)物口腔和食道，在腸道發(fā)揮作用，同時(shí)還可在消化酶作用下降解成易被腸道吸收的具有免疫活性的小肽(Fab)，轉(zhuǎn)運(yùn)至血液黏附病原體，或與宿主血液中的球蛋白末端結(jié)合免遭機(jī)體破壞[15-16]。同時(shí)，IgY不與哺乳動(dòng)物及水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)及補(bǔ)體系統(tǒng)反應(yīng)、不結(jié)合類風(fēng)濕因子或Fc受體等[17]，使用更安全。IgY產(chǎn)自雞蛋，產(chǎn)量高且獲取方便，此外，還具有營(yíng)養(yǎng)全面、富含生物活性物質(zhì)、誘食性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[18-19]。因此，突破規(guī)?；崛〉募夹g(shù)瓶頸將極大地推進(jìn)IgY在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用。

圖4 抗草魚(yú)IL-1β IgY提取液中細(xì)菌含量測(cè)定

酸化水提取IgY工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，除脂效果好，但提取液中仍有脂類與蛋白質(zhì)結(jié)合。研究首次將維生素C碳點(diǎn)應(yīng)用于IgY的酸化水提取，分析了維生素C碳點(diǎn)對(duì)IgY提取效果及二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，添加維生素C碳點(diǎn)有助于卵黃中水溶性蛋白的提取和抗體效價(jià)的提高，且低濃度維生素C碳點(diǎn)提取IgY的效果較好。圓二色光譜分析也表明，添加終濃度6.25和12.50 mg·L-1的維生素C碳點(diǎn)，使抗草魚(yú)IL-1β IgY二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量分別較對(duì)照組提高了12.6%和5.8%，而25.00 mg·L-1組含量與對(duì)照組基本相同，出現(xiàn)這一結(jié)果，推測(cè)可能與維生素C碳點(diǎn)表面的羥基、羧基和氨基等官能團(tuán)引起的極佳水溶性和化學(xué)反應(yīng)性有關(guān)。這些官能團(tuán)可與IgY結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基相互作用，形成氫鍵或者范德華力等作用力[20]，提高蛋白質(zhì)的水溶性，IgY構(gòu)象發(fā)生變化，但同時(shí)這種作用力的形成具有競(jìng)爭(zhēng)性，低濃度可以促進(jìn)α-螺旋的形成，提高IgY剛性，濃度過(guò)高則不利于氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成；此外IgY構(gòu)象的改變可能影響到了IgY的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致高濃度維生素C碳點(diǎn)組的抗體效價(jià)不及低濃度組的高，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。維生素C碳點(diǎn)的添加能有效抑制IgY提取液中細(xì)菌的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)室溫條件下提取IgY，其殺菌原理是維生素C碳點(diǎn)可以通過(guò)破壞細(xì)胞壁擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌和真菌細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)菌和真菌的DNA和RNA結(jié)合，抑制rSNPs基因表達(dá)，并最終殺死細(xì)菌和真菌[21]。

口服用IgY對(duì)純度要求不高，本研究發(fā)現(xiàn)添加維生素C碳點(diǎn)后1∶5～1∶9比例的緩沖液提取IgY均可達(dá)到很好的效果且菌含量極低，所以可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用情況確定緩沖溶液的比例。

4 結(jié) 論

與傳統(tǒng)的酸化水提取方法相比，緩沖溶液中添加6.25 mg·L-1的維生素C碳點(diǎn)，一方面可以進(jìn)一步提高IgY得率，所得IgY穩(wěn)定性好，解決了現(xiàn)有技術(shù)中提取卵黃抗體方法中存在成本大、抗體損耗大的問(wèn)題，另一方面，IgY提取過(guò)程可在室溫進(jìn)行，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便；同時(shí)解決了常規(guī)方法中提取液中殘留的有機(jī)物及高劑量防腐劑對(duì)動(dòng)物或人體存在潛在風(fēng)險(xiǎn)的技術(shù)問(wèn)題；此外，因維生素C碳點(diǎn)具有良好的生物相容性，所以沉淀物還可開(kāi)發(fā)為食品或飼料原料，或進(jìn)一步用于卵黃高磷蛋白的提取[22]等，提高利用率，實(shí)現(xiàn)零污染。