郭冰倩，王逸夫，郭雅婕，葉 雨，黃 燕，陳虹霏，蔣永華，莫曾南△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究中心；2.再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開發(fā)應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心；3.第二附屬醫(yī)院，南寧 530021）

近年來，隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展使得人們能夠從單細(xì)胞層面研究不同組織的細(xì)胞構(gòu)成、發(fā)育軌跡及細(xì)胞相互作用[1-3]。其中單細(xì)胞懸液制備是單細(xì)胞測序技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。使用不同單細(xì)胞懸液的制備方法可以得到不同的細(xì)胞類型，Schneider等[5]研究表明，與酶解離人類睪丸組織相比，機(jī)械解離后體細(xì)胞標(biāo)記基因ACTA2和VIM的表達(dá)顯著降低，精原細(xì)胞標(biāo)記基因FGFR3和SALL4的表達(dá)增加。腎上腺組織由多種細(xì)胞構(gòu)成，如類固醇細(xì)胞，髓質(zhì)細(xì)胞，它們的祖細(xì)胞，免疫細(xì)胞及各種間質(zhì)細(xì)胞[6]。本文使用了3 種單細(xì)胞懸液的制備方法，比較了不同方法的單細(xì)胞數(shù)量、活性及相對(duì)基因表達(dá)水平，為腎上腺組織單細(xì)胞懸液的制備提供了一種最佳的方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 取來自廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的手術(shù)終止妊娠的16～18 孕周胎兒腎上腺組織3 例，該研究已經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意（批件號(hào)：KY-0096），受試者簽署了知情同意書，放置轉(zhuǎn)移液（含10% 胎牛血清和1% 雙抗的RPMI 1640）中轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），臺(tái)盼藍(lán)染液，雙抗和Hank's 平衡鹽溶液（HBSS）購自美國Gibco 公司；杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自加拿大Wisent公司；Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶和DNase Ⅰ購自瑞士羅氏公司；紅細(xì)胞裂解液購自美國Biolegend公司，100 μm濾網(wǎng)和40 μm濾網(wǎng)購自美國BD 公司；牛血清白蛋白（BSA）購自美國Sigma 公司；CYP17A1 抗體購自美國Santa cruz 公司；CHGA抗體購自美國賽默飛公司；偶聯(lián)熒光集團(tuán)488 驢抗小鼠二抗和偶聯(lián)熒光集團(tuán)647驢抗小鼠二抗購自英國Abcam 公司。電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），超凈工作臺(tái)，離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國），顯微鏡（OLYMPUS 公司，日本），熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士），流式細(xì)胞儀（C6 Plus，BD公司，美國）。

1.3 單細(xì)胞懸液的制備 使用電子天平對(duì)腎上腺組織進(jìn)行稱重，將每例腎上腺組織分為3 份（各0.1 g），使用D-PBS清洗兩次后，分別使用3種消化方案（A 方案：HBSS 溶液中加入1 mg/mLⅠ型膠原酶，0.1 mg/mL DNase Ⅰ；B 方案：HBSS 溶液中加入1 mg/mLⅡ型膠原酶，0.1 mg/mL DNase Ⅰ；C 方案：HBSS 溶液中加入1 mg/mL Ⅳ型膠原酶，0.1 mg/mL DNase Ⅰ）進(jìn)行消化，在37 ℃水浴鍋中溫柔晃動(dòng)消化20 min，加入含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基終止消化，使用100 μm濾網(wǎng)過濾，300 g離心5 min，然后加入PBS清洗后離心棄上清，細(xì)胞沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min，加入含1% FBS 的DPBS 終止裂解，使用40 μm 濾網(wǎng)過濾，300 g 離心5 min，然后加入PBS清洗后離心棄上清，細(xì)胞沉淀使用含1%BSA的PBS重懸。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)染色 取10 μL 細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染液1∶1 混合，室溫下反應(yīng)2 min，取混合液滴加入計(jì)數(shù)板中，計(jì)算細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞存活率。

1.5 mRNA 測序及數(shù)據(jù)分析 對(duì)使用3 種消化方案得到的細(xì)胞（2 個(gè)生物學(xué)重復(fù)）使用Trizol 法提取總RNA，然后富集mRNA，逆轉(zhuǎn)錄形成雙鏈cDNA后純化并構(gòu)建文庫。將文庫送至上海偉寰生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序平臺(tái)為Illumina Nova-Seq。對(duì)下機(jī)后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量Reads并使用FastQC對(duì)過濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估分析。通過HISAT2軟件將過濾后數(shù)據(jù)與人類基因組進(jìn)行比對(duì)，并利用String Tie軟件重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本。利用R語言DESeq2 工具包進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P.adjust＜0.05 且|log2FoldChange|＞1，然后進(jìn)行KEGG通路分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）3 種消化方案得到的細(xì)胞使用Trizol 法提取RNA，然后使用Prime Script RT reagent Kit（日本TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒（日本TaKaRa 公司）說明書進(jìn)行反應(yīng)體系配置和DNA擴(kuò)增，得到CT值后計(jì)算2-ΔΔCT得到目的基因相對(duì)表達(dá)量。使用的引物序列見表1。GAPDH引物購自捷尼斯生物。

表1 目的基因及引物序列（5'～3'）

1.7 流式細(xì)胞分析 取3 種消化方案制備的單細(xì)胞懸液，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，使用fixation buffer（美國Biolegend）室溫避光固定20 min，隨后用1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer（美國Biolegend）清洗2 次，1 500 r/min 離心5 min 后使用100 μL 1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer 重懸。然后分別加入CYP17A1、CHGA 抗體室溫反應(yīng)30 min，陰性對(duì)照組加入PBS，然后用1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer 清洗2 次，1 500 r/min 離心5 min。隨后分別加入偶聯(lián)熒光集團(tuán)647、488的二抗室溫反應(yīng)30 min，然后用1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer 清洗2 次，1 500 r/min 離心5 min，用500 μL PBS重懸上機(jī)檢測。使用flowjo 10.5.3軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖，所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。RT-qPCR和流式結(jié)果采用雙因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同消化方案對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 鏡檢觀察可發(fā)現(xiàn)A 方案、B 方案消化得到的單細(xì)胞懸液結(jié)團(tuán)少、形態(tài)完整、邊界清楚、雜質(zhì)及細(xì)胞碎片較少、背景較干凈，而C 方案消化得到的單細(xì)胞懸液有少量結(jié)團(tuán)，見圖1。

圖1 人腎上腺組織單細(xì)胞懸液鏡檢

2.2 不同消化方案對(duì)細(xì)胞數(shù)量和存活率的影響 使用不同消化方案消化人腎上腺組織得到的單細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞存活率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。A 方案消化得到的單細(xì)胞數(shù)（2.94±0.59）×105與B 方案消化得到的單細(xì)胞數(shù)（3.72±0.60）×105比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與C 方案消化得到的單細(xì)胞數(shù)（5.41±0.20）×105相比，A 方案消化得到的單細(xì)胞數(shù)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與B 方案消化得到的細(xì)胞存活率（91.03±0.95）%和C 方案消化得到的細(xì)胞存活率（92.43±0.51）%相比，A方案消化得到的細(xì)胞存活率（83.90±1.20）%較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。B 方案消化得到的細(xì)胞存活率與C 方案消化得到的細(xì)胞存活率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與B 方案消化得到的單細(xì)胞數(shù)相比，C 方案消化得到的單細(xì)胞數(shù)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 不同消化方案的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 不同消化方法的差異基因表達(dá)及功能分析 為了解不同消化方法得到的細(xì)胞基因表達(dá)水平，本研究進(jìn)行了mRNA測序。通過差異基因比較分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)使用B方案消化與A方案消化對(duì)比，共有17個(gè)差異表達(dá)mRNA，其中9個(gè)基因上調(diào)，8個(gè)基因下調(diào)；使用B方案消化與使用C方案消化對(duì)比，共有20個(gè)差異表達(dá)mRNA，其中10個(gè)基因上調(diào)，10個(gè)基因下調(diào)；使用A 方案消化與使用C 方案消化對(duì)比，共有9個(gè)差異表達(dá)mRNA，其中1個(gè)基因上調(diào)，8個(gè)基因下調(diào)。通過對(duì)差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的信號(hào)通路分析，本研究發(fā)現(xiàn)使用B 方案消化得到的細(xì)胞更多的富集在類固醇合成代謝通路，說明使用B 方案消化可能獲得更多的類固醇細(xì)胞，見圖3。

圖3 差異基因火山圖，聚類分析熱圖及KEGG通路分析

2.4 不同消化方案的基因表達(dá)水平 腎上腺組織由多種細(xì)胞組分構(gòu)成，本研究比較了3 種消化方案得到的多種細(xì)胞關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，見圖4。與使用A方案消化和C方案消化對(duì)比，類固醇細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志基因CYP11A1，CYP17A1，CYP11B1在使用B 方案消化時(shí)表達(dá)較高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。與使用A 方案消化和C方案消化對(duì)比，調(diào)控皮質(zhì)醇分泌的基因MC2R在使用B 方案消化時(shí)表達(dá)較高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。A 方案消化和B 方案消化獲得的類固醇調(diào)控基因SF-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與C 方案消化對(duì)比，使用B 方案消化時(shí)類固醇調(diào)控基因SF-1表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)于髓質(zhì)細(xì)胞，與使用A 方案消化和C 方案消化對(duì)比，成熟的嗜鉻細(xì)胞標(biāo)志基因CHGA在使用B方案消化時(shí)表達(dá)相對(duì)較高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。然而神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志基因NESTIN使用3 種酶消化的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，包膜細(xì)胞標(biāo)志基因PTCH1和干細(xì)胞標(biāo)志基因NANOG使用3種酶消化的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 不同消化方案的腎上腺細(xì)胞相對(duì)基因表達(dá)水平

2.5 流式細(xì)胞分析不同消化方案的蛋白表達(dá)水平 除了細(xì)胞關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，本研究還通過流式細(xì)胞術(shù)分析了3種消化方案得到的細(xì)胞關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)水平，見圖5。流式細(xì)胞染色結(jié)果表明，在使用B 方案消化時(shí)，CYP17A1 陽性細(xì)胞和CHGA陽性細(xì)胞均有更高的比例，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖5 不同消化方案的腎上腺細(xì)胞標(biāo)志基因流式染色結(jié)果

3 討論

腎上腺位于腎臟上方，其主要由外側(cè)的皮質(zhì)和內(nèi)側(cè)的髓質(zhì)組成，皮質(zhì)由被膜下的球狀帶，中間的束狀帶，靠近髓質(zhì)的網(wǎng)狀帶構(gòu)成[7]。球狀帶主要產(chǎn)生鹽皮質(zhì)激素醛固酮，其主要功能是控制血流量和鹽/水平衡。束狀帶主要產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇，其不僅影響代謝，還在心血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)發(fā)揮了作用。網(wǎng)狀帶主要生產(chǎn)脫氫表雄酮，其主要作為睪酮或雌二醇的前體，同時(shí)通過其與皮質(zhì)醇的拮抗作用而對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮有益的作用。髓質(zhì)分泌兒茶酚胺類激素（腎上腺素和去甲腎上腺素），是一類應(yīng)激擬交感“斗或逃”激素[8-9]。腎上腺相關(guān)的內(nèi)分泌功能紊亂可以分為機(jī)能減退紊亂（如腎上腺功能不全）和機(jī)能亢進(jìn)紊亂（如高醛甾酮癥，皮質(zhì)醇增多癥，雄激素增多癥和兒茶酚胺過量）[10]。胚胎時(shí)期腎上腺的正常發(fā)育和功能對(duì)影響胎兒自身或新生兒健康也至關(guān)重要。研究報(bào)道先天性腎上腺增生患者會(huì)引起性腺功能障礙，從而影響患者的生育功能[11]。因此，研究胎兒腎上腺的內(nèi)分泌功能對(duì)維持人體生理健康具有重要意義。然而，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類胎兒腎上腺的內(nèi)分泌功能不一致[12]，難以通過動(dòng)物模型對(duì)腎上腺的內(nèi)分泌功能及相關(guān)疾病進(jìn)行研究。

單細(xì)胞測序技術(shù)自2009年首次問世，其發(fā)展迅速，已被證明是識(shí)別細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)罕見的細(xì)胞類群，追蹤細(xì)胞的發(fā)育軌跡的一種強(qiáng)有力的工具[13]。目前，單細(xì)胞測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)等[14-15]，為解決生物和醫(yī)學(xué)問題提供了一種新的可能性。其中，單細(xì)胞測序技術(shù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是單細(xì)胞懸液的制備。目前，研究報(bào)道了成人腎上腺組織使用Ⅳ型膠原酶消化后進(jìn)行單細(xì)胞測序[16]。然而，對(duì)于胚胎時(shí)期腎上腺的單細(xì)胞懸液制備方法的比較，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這限制了單細(xì)胞測序技術(shù)在胚胎時(shí)期腎上腺研究中的應(yīng)用。因此，為了從單細(xì)胞層面對(duì)胚胎時(shí)期腎上腺組織進(jìn)行深入研究，獲取一種最佳的單細(xì)胞懸液制備方法十分必要。實(shí)體組織的消化方法不是單一的，組織不同消化方法不同，甚至同一組織由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌椒ㄒ膊煌?。機(jī)械打散法獲得的細(xì)胞碎片較多，造成大量細(xì)胞損傷同時(shí)細(xì)胞產(chǎn)量也較低[17]。不同組織選取的酶消化法也是不同的，研究報(bào)道大鼠肺組織使用胰酶消化[18]，小鼠肺組織應(yīng)用膠原酶Ⅴ消化[19]，人瘢痕組織采用改良聯(lián)合酶消化法消化效果更佳[20]。由于腎上腺結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使得我們?cè)谶x擇消化方法時(shí)也應(yīng)該考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，所要研究的?xì)胞不同應(yīng)使用不同的消化方案。

本研究采用了機(jī)械—酶消化法，先使用剪刀剪碎組織，在采用Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶或Ⅳ型膠原酶來消化組織，并對(duì)獲得的細(xì)胞形態(tài)，單細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞存活率及關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行分析，以確定最佳的消化方案。與使用A 方案和B 方案消化對(duì)比，使用C 方案消化能得到較高的細(xì)胞產(chǎn)量[（5.41± 0.20）×105]，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），然而其細(xì)胞團(tuán)塊相對(duì)較多。與使用C方案消化對(duì)比，使用B方案消化得到的細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞碎片及結(jié)團(tuán)少，然而其細(xì)胞產(chǎn)量[（3.72±0.60）×105]較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。使用B方案和C 方案消化對(duì)比，兩者細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

單細(xì)胞測序可以在單細(xì)胞水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增與測序，從而解決了普通轉(zhuǎn)錄組不能精確到細(xì)胞類型的問題[21]。為了獲取腎上腺組織單細(xì)胞懸液中細(xì)胞類型的信息，本研究對(duì)使用3 種酶消化得到的單細(xì)胞懸液通過mRNA測序，RT-qPCR和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行了檢驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)了與使用A 方案消化和C 方案消化對(duì)比，腎上腺類固醇細(xì)胞表達(dá)的基因CYP11A1，CYP17A1，CYP11B1[22]在使用B 方案消化時(shí)表達(dá)較高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)于髓質(zhì)細(xì)胞，與使用A方案消化和C 方案消化對(duì)比，成熟的嗜鉻細(xì)胞標(biāo)志基因CHGA[22]在使用B 方案消化時(shí)表達(dá)較高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。包膜細(xì)胞標(biāo)志基因PTCH1[22]和干細(xì)胞標(biāo)志基因NANOG[22]在使用3種膠原酶消化時(shí)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，與C方案消化相比，盡管B方案消化腎上腺組織所得到的單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)[（3.72 ±0.60）×105]較低，但其細(xì)胞形態(tài)完整、結(jié)團(tuán)少、邊界清楚、雜質(zhì)及細(xì)胞碎片較少、背景較干凈，此外，與A方案消化相比，B 方案消化所得到的單細(xì)胞懸液細(xì)胞存活率（91.03±0.95）%較高。同時(shí)，腎上腺內(nèi)最主要的細(xì)胞類型（類固醇細(xì)胞和髓質(zhì)細(xì)胞），與A方案和C 方案消化相比，其關(guān)鍵基因在使用B 方案消化時(shí)表達(dá)較高。因此，本研究認(rèn)為使用B 方案消化是較優(yōu)選的單細(xì)胞懸液制備方法。但是，本研究有一定的局限性，本實(shí)驗(yàn)僅采用了1 mg/mL的酶濃度，消化時(shí)間未作比較以及未使用聯(lián)合酶消化方法，因此今后在本研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究可能探索出一種更優(yōu)的腎上腺組織消化方法。