高娟娟 黎陽 王中林 馮艾 李娜 惠凌云★

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一。2020年我國CRC 發(fā)病率居惡性腫瘤譜第二位，死亡率位居第五位［1］。30%～50%的CRC 患者在治療后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移，這是CRC 患者最主要的死亡原因［2］。CRC 常用的實驗室檢查［3］包括糞便免疫化學實驗和血清癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）檢 測，其 作 為CRC 早期篩查和復發(fā)監(jiān)測指標均存在靈敏度不高、器官特異性不強的弊端［4?5］。DNA 甲基化與多種腸道疾病的發(fā)生密切相關。Septin9基因甲基化（MethylatedSeptin9，mSEPT9）存在于90%以上的CRC 腫瘤組織中，通過檢測外周血中Septin9基因是否發(fā)生甲基化可判斷CRC 的發(fā)生風險［6?8］。目前，mSEPT9 作為CRC 診斷指標得到了一致認可，而手術治療是早期CRC 患者獲得根治的唯一模式，外科手術水平可決定腫瘤患者的預后。然而，鮮有文獻報道將mSEPT9 作為手術治療效果的評價指標；CRC 復發(fā)轉(zhuǎn)移嚴重威脅患者的生存時間和質(zhì)量，選擇高靈敏的實驗室復發(fā)監(jiān)測指標至關重要，能否建立聯(lián)合診斷模式提高檢驗效能，本研究將圍繞以上問題深入探討。

1 方法

1.1 研究對象

以2017年6月至2020年1月西安交通大學第一附屬醫(yī)院確診的243 例CRC 患者為研究對象。納入標準：依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)盟（AJCC/UICC）結(jié)直腸癌TNM 分級系統(tǒng)（2017年第8 版）［9］，經(jīng)結(jié)直腸內(nèi)窺鏡及組織病理學確診為CRC，同時在疾病不同時期同步檢測mSEPT9 和CEA；排除標準：患有其他惡性腫瘤，或患有其他嚴重影響身體機能的重大疾病。納入的CRC 患者包括：119 例均未進行手術或抗腫瘤治療的術前患者（術前組）；99 例術后患者（術后組），均于手術后14～21 天內(nèi)檢測本研究指標；25 例術后復發(fā)患者（術后復發(fā)組），均經(jīng)影像學確診腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移。并以同期在醫(yī)院體檢的81 名健康人員（身體健康無腫瘤等相關惡性疾?。┳鳛榻】祵φ战M。共納入病例243 例，年齡（59.95±11.56）歲，其中男性140 名，女性103 名；健康對照組年齡（55.09±10.53）歲，其中男性52 名，女性29 名。病例組與健康對照組的性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。兩組年齡比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。本研究經(jīng)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

表1 研究對象的基本特征［n（%）］Table 1 Basic characteristics of research objects［n（%）］

1.2 研究方法

1.2.1 檢測試劑與儀器

mSEPT9 檢測：采用博爾誠（北京）科技有限公司生產(chǎn)的Septin9基因甲基化檢測試劑盒（PCR 熒光探針法，30 人份/盒），包括博爾誠血漿處理試劑盒和PCR 試劑盒；利用美國ABI 公司生產(chǎn)的7500型實時熒光定量PCR 儀進行檢測。

CEA 檢測：采用羅氏診斷公司（瑞士）生產(chǎn)的癌胚抗原測定試劑盒（電化學發(fā)光法，Elecsys CEA，300 測試/盒）；利用羅氏公司（瑞士）生產(chǎn)的cobas 8000 e 801 全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行檢測，參考區(qū)間為0～5 ng/L，檢測值>5 ng/L 為陽性結(jié)果。

1.2.2 血樣采集與制備

清晨空腹狀態(tài)下采集外周靜脈血2支，一支3 mL未抗凝處理，分離血清并于當日檢測CEA；另一支10 mL 注入EDTA 抗凝管中，在采血4 h 內(nèi)離心10 min（2 150*g）分離血漿，經(jīng)二次離心后獲得3.5 mL血漿置-80℃冰箱，并于兩周內(nèi)完成mSEPT9檢測。

1.2.3 mSEPT9 檢測

主要操作步驟：血漿DNA 提取、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA（Bis DNA）結(jié)合、Bis DNA 洗滌和PCR 擴增。以人類管家基因ACTB（β?actin）作為內(nèi)參照，評估檢測中DNA 量是否足夠，每批次試驗同步陰性和陽性質(zhì)控品檢測。根據(jù)擴增循環(huán)數(shù)（Cycle threshold，Ct）分析結(jié)果。

結(jié)果判讀：同步檢測質(zhì)控品結(jié)果滿意的條件下，樣本檢測Ct 值≤41.0，ACTB 的Ct 值≤32.1 為陽性結(jié)果；樣本檢測Ct 值>41.0 或無Ct 值，ACTB 的Ct 值≤32.1 為陰性結(jié)果；ACTB 的Ct 值>32.1 為無效檢測。由西安交通大學第一附屬醫(yī)院檢驗科完成檢測。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher's exact test。采用受試者工作特征（ROC）曲線和曲線下面積（AUC）比較兩種檢測方法對疾病的鑒別能力。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 mSEPT9 檢測的影響因素

在不同性別、年齡段、腫瘤分化程度和腫瘤位置的CRC 術前組患者中，mSEPT9 檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與Ⅰ～Ⅱ期腫瘤比較，Ⅲ～Ⅳ期腫瘤mSEPT9 檢測的陽性率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；潰瘍型和浸潤型腫瘤的mSEPT9 陽性率高于隆起型腫瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。與隆起型腫瘤比較，潰瘍型腫瘤中Ⅲ～Ⅳ期的比例較高，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。不同腫瘤類型病例中，腫瘤分期和腫瘤分化程度中的比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

表2 CRC 術前組mSEPT9 檢測的影響因素分析［n（%）］Table 2 Influencing factors of mSEPT9 among preoperative CRC patients［n（%）］

表3 CRC 術前組腫瘤類型與腫瘤分期及腫瘤分化程度的關系［n（%）］Table 3 The relationship between tumor type and tumor stage and tumor differentiation in preoperative group of CRC［n（%）］

2.2 mSEPT9 和CEA 檢測結(jié)果在CRC 術前組與健康對照組的比較

CRC 術前組與健康對照組的mSEPT9和CEA 檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

表4 mSEPT9 和CEA 檢測結(jié)果在CRC 術前與健康對照組比較［n（%）］Table 2 Distribution of mSEPT9 and CEA among preoperative CRC patients and healthy subjects［n（%）］

2.3 mSEPT9 和CEA 檢測結(jié)果在CRC 術前、術后及術后復發(fā)組的比較

CRC 術前、術后及術后復發(fā)組mSEPT9 的陽性率分別為77.3%、26.3%和96.0%；CEA 的陽性率分別為50.4%、33.3%和80.0%。mSEPT9 在術前組的檢測陽性率高于CEA，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；mSEPT9 在術后組的檢測陰性率高于CEA，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；mSEPT9 在術后復發(fā)組的檢測陽性率高于CEA，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5、圖1。

表5 mSEPT9 和CEA 檢測結(jié)果在CRC 患者術前、術后及術后復發(fā)組間比較［n（%）］Table 5 DistributionofmSEPT9andCEAamongpreoperative，postoperative，and recurrent CRC patients［n（%）］

圖1 mSEPT9 與CEA 在CRC 手術前、后及術后復發(fā)組中的陽性率Figure 1 The positive rates of mSEPT9 and CEA in preoperative，postoperative，and recurrent CRC patients

2.4 mSEPT9、CEA 及聯(lián)合診斷在CRC 術后復發(fā)中的檢測效能評價

CRC 術后復發(fā)組mSEPT9 檢測靈敏度為96%，CEA 為80%，兩項聯(lián)合檢測為100%。在CRC 復發(fā)組中，mSEPT9 單項 的AUC 達0.955，CEA 則為0.857，兩項聯(lián)合檢測的AUC 為0.932。見表6、圖2。

圖2 ROC 曲線Figure 2 ROC curve

表6 CRC 術后復發(fā)組mSEPT9、CEA 及兩項聯(lián)合檢測的檢驗效能Table 6 The efficacy of mSEPT9，CEA and the combined tests for CRC recurrence monitoring

3 討論

CRC 術后患者較高的轉(zhuǎn)移復發(fā)率是導致其死亡率高的重要原因［10］。因此，簡單快捷、靈敏度高的實驗室檢測方法，有助于早期診斷CRC 和及時發(fā)現(xiàn)復發(fā)患者，具有重要的臨床意義。

本研究顯示，在CRC 術前組中，mSEPT9 檢測陽性率為77.3%；而CEA 的檢出率僅為50.4%，因此，mSEPT9 作為CRC 分子水平診斷指標優(yōu)于CEA。在對mSEPT9 檢測結(jié)果的影響因素分析中，發(fā)現(xiàn)mSEPT9 陽性檢出率與CRC 的腫瘤類型有關，浸潤型和潰瘍型腫瘤的mSEPT9 陽性率高于隆起型，進一步分析發(fā)現(xiàn)，潰瘍型腫瘤TNM 分期高于隆起型腫瘤，但差異無統(tǒng)計學意義。這可能是浸潤型和潰瘍型腫瘤生長過程中更易引起脈管侵犯，進而導致甲基化程度增加。同時，mSEPT9 在CRC 中晚期檢測靈敏度高于早期，隨著腫瘤進展其陽性率逐漸升高。因此，建議根據(jù)CRC 患者mSEPT9 檢測結(jié)果、腫瘤類型及腫瘤分期制定個性化分級管理方案，將獲得較好的治療效果。

既往研究發(fā)現(xiàn)，CRC 患者術后mSEPT9 由陽性轉(zhuǎn)成陰性［11?12］。本研究的術后組與術前組比較發(fā)現(xiàn)，術后組CEA 陽性率從50.4%降低到33.3%，而mSEPT9 的陽性率從77.3%降到22.7%，提示手術切除實體瘤后，mSEPT9 比CEA 更早轉(zhuǎn)陰。且mSEPT9 在術后復發(fā)組的陽性率達96%。因此，mSEPT9 作為分子水平的腫瘤標志物，其檢測結(jié)果與腫瘤發(fā)生、手術清除以及腫瘤侵襲復發(fā)的變化過程有較高的一致性，其靈敏度優(yōu)于CEA。另有研究表明，術后血漿mSEPT9 持續(xù)陽性與即將發(fā)生的復發(fā)或轉(zhuǎn)移（1年內(nèi)）高度相關［6］。對術后mSEPT9 檢測持續(xù)陽性患者應視為高危人群進行有效監(jiān)管，增加隨訪、檢查頻次，以便盡早發(fā)現(xiàn)不良轉(zhuǎn)歸患者，確定下一步治療方案。

術后CEA 持續(xù)升高一般提示預后不良，此類患者有較高的復發(fā)風險［13?14］。本研究顯示，在CRC復發(fā)組，CEA 陽性率為80%，AUC 為0.855；而mSEPT9 的陽性率達96.0%，AUC 值達0.955。mSEPT9 作為CRC 復發(fā)預測指標檢驗效能優(yōu)于CEA。將兩項聯(lián)合檢測，靈敏度可達100%。由此可見，mSEPT9 和CEA 聯(lián)合檢測可提高腫瘤復發(fā)檢測的靈敏度。本研究不足之處在于納入的樣本量有限，還有待更大樣本量的驗證。

綜上所述，在CRC 患者手術治療效果評價中，mSEPT9 靈敏度優(yōu)于CEA；在腫瘤復發(fā)監(jiān)測中，mSEPT9 同樣顯示了較滿意的診斷效能，二者聯(lián)合檢測可提高腫瘤復發(fā)預測的靈敏度，具有重要的臨床應用價值。