梁志坤 孫榮同 吳軼蘭 王琳 唐翠燕

感染性疾病作為全球十大死亡原因之一，時刻威脅著患者的生命健康。其根本原因在于現(xiàn)有的病原鑒定技術(shù)，包括微生物的培養(yǎng)和分離、特異性病原抗體的檢測和微生物核酸［DNA（Deoxyribonucleic acid）或RNA（Ribonucleic Acid）］檢測［PCR（Poly?merase Chain Reaction）］等無法滿足臨床需求［1?3］。病原宏基因組高通量測序（mNGS，Metagenomics next?generation sequencing）技術(shù)理論上能“無偏倚”地檢出全部潛在病原體，包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲等［4］，尤其適用于病原不明的疑難感染性疾病的診斷［5?7］。也正是得益于mNGS 技術(shù)，才能在新型冠狀病毒疫情初期迅速發(fā)現(xiàn)并鑒定出這一新發(fā)病原體［8］。

mNGS 技術(shù)適用于幾乎所有類型的臨床樣本。主要有靜脈血、腦脊液、肺泡灌洗液、痰液、胸水和腹水組織等。不同樣本核酸提取前需進行不同的前處理，比如離心、過濾、液化、破壁、去宿主等以提高病原體檢出率。

專家共識中也都指出樣本前處理和核酸提取為mNGS 技術(shù)流程的質(zhì)量控制的重要節(jié)點［9?10］。無菌部位的標本（靜脈血、腦脊液、胸腔積液、組織等）具有更高的臨床價值，應盡量送檢無菌部位的標本［10］。因此，本文通過對mNGS 無菌部位臨床樣本處理方法進行綜述，著重闡述常見無菌部位樣本的特性及處理方法，以期為醫(yī)療工作者及科研人員提供詳實的參考信息。

1 病原宏基因組高通量測序技術(shù)原理

mNGS 檢測過程主要包括實驗操作（濕實驗）和生信分析（干實驗）兩個部分，具體是將臨床感染患者樣本中的全部核酸片段化后進行測序，然后再應用生物信息學分析軟件將測序結(jié)果與相關(guān)病原體數(shù)據(jù)庫中的參考序列進行對比、分析和鑒定，見圖1。

圖1 mNGS 技術(shù)原理［4］Figure 1 mNGS technology principle［4］

與傳統(tǒng)的病原體核酸診斷技術(shù)（PCR、基因芯片、核酸雜交技術(shù)）相比，mNGS 能在較短的時間內(nèi)完成對樣本的無靶向檢測，單次即可檢測上千種病原體，檢測的病原體種類包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲等［11?12］。

2 無菌部位臨床樣本處理方法

mNGS 技術(shù)相當于是“草垛尋針”，既要考慮草垛的數(shù)量，也要考慮針的數(shù)量，即草垛和針的比例。測序數(shù)據(jù)中僅有1%的reads 是非人源的，而這1%又僅有少部分是屬于病原的［2］。不同的臨床樣本中所含的人核酸含量不同。因此，需要根據(jù)不同種類的臨床樣本核酸特點設(shè)計樣本前處理的具體方法，如痰液液化、組織研磨和切片脫蠟等，來保證檢測的可靠性。以下總結(jié)了不同實驗室針對感染性疾病無菌部位樣本的處理方法。

2.1 血液

血漿cfDNA（Circulatingfree DNA）中存在引起機體不同部位感染的病原體基因組DNA 片段。因此，對外周血中微生物cfDNA 進行測序，可以提高對多種感染進行無創(chuàng)檢測的可能性［5］。血液樣本處理方法如下：

將大于1.2 mL的血漿樣本解凍，加入已知濃度的合成的分子質(zhì)控，16 000 g離心10 min，收集血漿。用改進的Mag?Bind cfDNA kit（M3298，Omega Biotek，USA）提取0.25 mL血漿的cfDNA［5］，或者用TIANamp Micro DNA Kit（DP316，TIANGEN BIOTECH，Bei?jing，China）提取300 μL血漿中的DNA［11］。

對于血液樣本，一般是建議采集后立即離心收集血漿來進行長期保存。與血培養(yǎng)不同，mcfDNA檢測容易受溶血、乳糜血的影響，與高人源背景的影響相似［5］，當標本出現(xiàn)嚴重的溶血、乳糜血時，微生物檢出不足，容易造成假陰性。

2.2 腦脊液

顱內(nèi)感染會產(chǎn)生腦炎或腦膜炎的癥狀。腦脊液樣本核酸總量有時可能低于測序文庫制備所需的最低核酸起始量，需要考慮對樣本中的核酸進行富集，使用核酸回收率高的純化試劑盒。腦脊液樣本處理方法如下：

方法1［6］：600 μL CSF 用FastPrep?24 磁珠勻漿機（MPFastPrep?24 5G，MP biomedicals，USA）以6 m/s 的速度勻漿兩次，每次30 s，在4℃孵育5 min。以2 000 rpm 離心3 min 后留取400 μL 上清。將DNA 和RNA 質(zhì)控，包含DNA 和RNA 噬菌體的內(nèi)部質(zhì)控加入上清液中（以3×105和9×103copies/mL濃度），結(jié)果大約為1x103RPM，提取400 μL 樣本，使用的試劑盒為EZ1 Virus Mini Kit v2.0（955134，Qiagen，Germany），洗脫體積為60 μL。見圖2。

圖2 腦脊液樣本處理方法示意圖［6］Figure 2 Schematic diagram of cerebrospinal fluid sample processing method［6］

DNA 的富集：取25 μL 總核酸使用NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit （E2612S/L，New England Biolabs，USA）進行富集。該試劑盒通過選擇性抗體介導的甲基化DNA 去除來來富集微生物核酸，甲基化DNA 大部分來自人類宿主。

病毒RNA 的富集：取25 μL 總核酸，用3 μL of Turbo DNAse（AM2238/AM2239，Thermo ?fisher，USA）和1 μL Baseline DNase［（DB0715K，Epicentre（Illumina），USA］37℃處理30 min。然后使用RNA Clean & Concentrator Kit（R1013/R1014，Zymo Re?search，USA）對DNase進行終止，RNA 進行純化。

方法2［12］：病毒核酸提取前，100 μL 的腦脊液樣本先用Turbo DNase（AM2238/AM2239，Thermo?fisher，USA）和RNase I（AM2295/AM2294，Thermo?fisher，USA）處理，然后用QIAamp viral RNA kit（52904，Qiagen，Germany）提取病毒核酸。

方法3［13?14］：1.5～6 mL 腦脊液樣本使用QIAmp CircμLating Nucleic Acid Kit（55114，Qiagen，Ger?many）進行腦脊液上清液的cf DNA 提取，使用QIAamp DNA Mini Kit（51304，Qiagen，Germany）進行腦脊液細胞團的DNA 提取。

腦脊液是一種無菌體液，在采集的時候應注意無菌操作和防止血污染。腦脊液病原體核酸量較少，需要采用富集方法對核酸進行富集。另外，腦脊液中的病原主要以菌體的形式存在，在提取核酸時需要“破壁”處理，來提高胞內(nèi)菌/真菌的檢出率。

2.3 胸腔積液

胸腔積液的常見原因有胸膜或鄰近組織感染，常見致病菌有葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、脆弱類桿菌、綠膿桿菌等。胸腔積液樣本處理方法如下：使用MagNALyzer 儀（Roche Diagnostics GmbH，Switzerland）加上SeptiFast Lysis kit（Roche，Switzer?land）對細菌細胞進行機械破壁來獲得DNA，然后在MagNA Pure 緊湊型自動化儀器（MagNA Pure 96，Roche，Switzerland）上進行DNA 提取和純化［15］。胸腔積液中常見的病原為菌體，需要對樣本進行破壁處理以提高核酸提取效率。

2.4 關(guān)節(jié)積液

膝關(guān)節(jié)是人體滑膜最多，關(guān)節(jié)面最大和結(jié)果最復雜的關(guān)節(jié)，由于膝關(guān)節(jié)滑膜廣泛并位于肢體較表淺部位，故遭受損傷和感染的機會較多。如細菌感染造成的細菌性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核性滑膜炎等。關(guān)節(jié)積液樣本處理方法如下：

DNA 提取之前，使用MolYsis Basic5 kit（D?301?050，Molzym，Germany）通過促溶劑選擇性的裂解人源細胞，釋放出來的hDNA 使用MolDNase 降解。然后將樣品中存在的細菌沉淀，洗滌，然后使用MoBio Bacteremia DNA isolation kit（12240?50，Qiagen，Germany）進行DNA 提取和分離［16］。

關(guān)節(jié)積液的保存，必須離心除去細胞，因為細胞內(nèi)酶釋放出來會改變關(guān)節(jié)積液的成分，也會影響積液中病原核酸的組成，影響病原的檢出率。

2.5 感染的組織

與無菌體液相比，組織增加了人類宿主背景，導致微生物reads 數(shù)量和比例減少，從而導致mNGS 敏感性降低。所以需要去除人源宿主，大部分去除宿主的方法對唾液、血液或糞便樣本有利，但對感染的組織樣本是無效的。在DNA 提取前，對組織進行勻漿處理，可以使宿主細胞保留到裂解液中促進宿主細胞的裂解。感染組織樣本處理方法如下。

2.5.1 新鮮組織樣本

方法1（DNA 提?。?7］：為了選擇最有效的微生物提取方法來去除宿主DNA 的污染，又不影響感染組織樣本對微生物多樣性的分析。實驗者比較了5 種常見的DNA 提取方法。見圖3、表1。

表1 幾種去除宿主DNA 方法的優(yōu)劣勢比較［17］Table 1 Comparison of several advantages and disadvantages of removing host DNA［17］

圖3 新鮮組織樣本處理方法示意圖［17］Figure 3 Schematic diagram of fresh tissue sample processing method［17］

由于單份糖尿病足感染（DFI（Diabetic foot in?fection））活檢樣本體積小，實驗者將這5 份樣本混合在一起來比較5 種DNA 提取方法?？偣?80 mg 的混合DFI 樣本在1.5 mL 無核酸酶水中使用Tissue RuptorⅡinstrument（230 V，50/60 Hz，中速10 s）（9002756，Qiagen，Germany）進行勻漿處理。然后被分成15 等份，每一份含100 μL 約25 mg。使用5 種方法進行DNA 提取，每種提取方法重復三次，提取方法有High Pure PCR Template Preparation Kit（對照）（11796828001，Roche，Swit?zerland）、NEBNext Microbiome DNA enrichment kit（E2612S/L，NEB Inc，USA）、Molzym Ultra?Deep Microbiome Prep（G?020?025，Molzym，Germany）、QIAamp DNA Microbiome Kit（51704，Qiagen，Germany）、HostZERO microbial DNA kit（D4310，Zymo Research，USA）。18S/16S rRNA 定量PCR，16 s 擴增子測序結(jié)果顯示HostZERO 和QIAamp 試劑盒宿主DNA 的含量較低。

方法2（DNA 提?。簩⑷∽怨且浦蚕嚓P(guān)感染的病人的軟組織活檢樣本平均分成兩份，組織2（同樣大小和重量）。一份按Ultra?Deep Microbi?ome Prep kit（G?020?025，Molzym，Germany）說明書進行提取，另一份用改進的方法：延長蛋白酶K孵育時間（由原來的10 min 延長到20 min），接著裂解人細胞，降解細胞外DNA，細胞用1 mLTSB重懸，重復上一步驟，14 000xg 離心。使用HBB 和nuc?gene qPCR、MiION 測序來比較兩種方法。改進后的方法HBB 和nuc?gene qPCR 的ct 值都比未改進的方法高，MiION 測序后hDNA 的reads 數(shù)為1 755（為改進方法reads 數(shù)為60063）［18］。

方法3：新鮮組織冷凍樣本使用AllPrep DNA/RNA FFPE kit（80234，Qiagen，Germany）和QIAamp DNA microbiome kit（51704，Qiagen，Germany）［19］。

2.5.2 組織切片樣本

甲醛固定石蠟包埋處理會使組織樣本中核酸發(fā)生核酸發(fā)生斷裂或降解，需要對原始樣本進行脫蠟和DNA 修復后，AllPrep DNA/RNA FFPE kit（80234，Qiagen，Germany）和QIAamp DNA micro?biome kit（51704，Qiagen，Germany）對FFPE樣本進行總DNA 提?。?9］或使用GeneRead DNA FFPE Kit（180134，Qiagen，Germany）進行DNA的提取［20］。

組織樣本千差萬別，即使是同樣大小的組織樣本，來源不同，取樣時間的不同，細胞數(shù)量也是千差萬別的。對于肝臟和脾臟轉(zhuǎn)錄非常活躍的器官，其蛋白質(zhì)和RNA 含量都很高。因此在制備基因組DNA時，就可以適當減少組織用量。此外，有些組織中含有收縮蛋白、結(jié)締組織、膠原等，都提升了核酸提取的難度，需要根據(jù)組織樣本的特性做特殊的處理。對于FFPE，需要對其進行脫蠟和DNA 的修復。

3 總結(jié)

不同病原微生物的基因組大小不同（寄生蟲>真菌>細菌>病毒），核酸提取效率也存在差異［難易程度：病毒<革蘭陰性菌<革蘭陽性菌（不包括分枝桿菌、需氧放線菌等）<真菌］。應該根據(jù)病原微生物的特征選擇針對性的提取方法。比如，血液樣本的病原NGS 檢測的主要是血漿中的游離核酸cfDNA［21］。而組織標本中，其病原主要以菌體形式存在，核酸是存在于病原細胞中，所以對于這類標本會存在“破壁”的過程，讓核酸釋放出來再進行檢測［10］。臨床樣本多種多樣，但對于mNGS 技術(shù)來說，無菌部位樣本比無菌部位樣本更具臨床價值。因此，本文闡述了常見無菌部位樣本的特性及處理方法，以期為醫(yī)療工作者及科研人員提供詳實的參考信息。