孫梅 葛麗娜 謝龍 宋宇 林子鈺 叢海燕 劉鵬 張煥虎 遲翔宇 王明義★

Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）是一種來(lái)源于耐熱性細(xì)菌Thermus aquaticus 的耐熱性DNA 聚合酶，分子量94 KDa，在鎂離子存在的條件下，其最適反應(yīng)溫度為75～80℃，在95℃下的活性半衰期為40 min，具有5′?3′核酸外切酶活性［1］。由于其具有耐高溫的特性，因此廣泛用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），是核酸擴(kuò)增、檢測(cè)等反應(yīng)的首選用酶［1］。然而，這些原有的DNA 聚合酶不能有效的對(duì)特定DNA 片段進(jìn)行修飾，導(dǎo)致野生型Taq 酶無(wú)法完全滿足實(shí)際應(yīng)用的需求［2］。為使其更加適應(yīng)特定技術(shù)的使用，應(yīng)用蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)，對(duì)針對(duì)Taq 酶的聚合酶活性結(jié)構(gòu)域構(gòu)建隨機(jī)突變庫(kù)，通過(guò)逐步添加篩選壓力，使不適合的突變自然淘汰，具有優(yōu)勢(shì)性狀的突變逐步積累，最終篩選出一系列對(duì)Taq 酶擴(kuò)增性能、聚合性能有關(guān)鍵作用的氨基酸位點(diǎn)及其突變，并得到高擴(kuò)增性能的Taq 酶突變體［3?5］。乙型、丙型肝炎病毒屬于感染性疾病，以往臨床在對(duì)乙型肝炎病毒攜帶者進(jìn)行疾病檢測(cè)的過(guò)程中，主要選擇血清學(xué)標(biāo)志法［6］。本研究將改造后的Taq DNA 聚合酶突變體作為新型PCR 檢測(cè)手段，探究其在擴(kuò)增效率、靈敏度及特異性等方面與野生型存在的差異。

1 材料與方法

1.1 Taq DNA聚合酶突變體及野生型的構(gòu)建及篩選

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

PCR 反應(yīng)體系（10*Titanium Taq buffer、dGTP、50*Diversify dNTP Mix、TMu?F 引物、Titanium Taq、ddH2O，dNTPS、緩沖液、隨機(jī)引物、純水）（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；振蕩儀（XH?B 旋渦混合器，江蘇康健醫(yī)療用品公司，型號(hào)：171006）；ABI7300熒光定量PCR 儀（上海艾研生物科技有限公司）。

1.1.2 DNA 提取

取全血1 mL 至干燥玻璃試管，加入1 mL 生理鹽水輕搖混勻。將稀釋好的全血用移液器緩慢加入至含有淋巴細(xì)胞分離液的試管中；2 000 rpm/min離心半徑42.5 mm 離心20 min；吸取白細(xì)胞層，加入1.5 mL 離心管，12 000 rpm 離心5 min；去上清，沉淀中加入50 μL DNA 提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min；12 000 rpm 離心5 min 備用。

1.1.3 Taq 酶野生型的構(gòu)建

采用不對(duì)稱PCR 法構(gòu)建Taq 酶突變體，用不等量的非限制引物與限制性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的單鏈DNA 片段，該產(chǎn)物即為Taq酶野生型基因序列。

1.1.4 Taq 酶突變體的構(gòu)建及高通量篩選

在野生型DNA 聚合酶基礎(chǔ)上進(jìn)行突變（突變位點(diǎn)見(jiàn)表1），得到產(chǎn)物為Taq 酶突變體。將Taq酶突變體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，程序如下：95℃5 min，20 次循環(huán)X（95℃30 s、62℃30 s、72℃2 min）72℃5 min、4℃。PCR 產(chǎn)物用DNA 產(chǎn)物純化回收試劑盒純化，然后重新連接pET28a 表達(dá)載體。保持上述相同反應(yīng)條件進(jìn)行4 輪篩選后，將所得的Taq 酶突變體轉(zhuǎn)化子進(jìn)入高通量篩選。

表1 各型Taq 酶突變體突變位點(diǎn)Table 1 Mutant sites of various types of Taq enzyme mutants

1.1.5 Taq 酶野生型及突變型混合酶的制備

將上述制備的Taq 酶突變體與野生型Taq酶按設(shè)定比例，每個(gè)混合酶的濃度均為10 U/μL，見(jiàn)表2。配制的混合酶中，每個(gè)混合酶的濃度均為10 U/μL。按抗體活力：Taq 酶活=1∶1 的比例加入抗Taq 酶抗體（深圳菲鵬生物技術(shù)有限公司，MD010），37℃孵育30 min，-20℃保存。

表2 各型混合酶配置比例Table 2 Proportion of various types of mixed enzymes

1.1.6 TaqMan 探針定量多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)基因單點(diǎn)突變

使用TaqMan 探針的實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（FQ?PCR）技術(shù)，針對(duì)上述野生型Taq 酶突變位點(diǎn)，分別用特異引物和非特異引物進(jìn)行FQ?PCR檢測(cè)，通過(guò)兩次反應(yīng)Ct 值大小的比較及兩者差值A(chǔ)G 的大小，判斷該突變位點(diǎn)是野生型純合子、突變型純合子和雜合子三者之一。

1.1.7 有效性判斷

野生型模板臨界質(zhì)控品和突變型模板臨界質(zhì)控品均分別檢測(cè)為野生型純合子和突變型純合子；對(duì)每一樣品，用PCR 反應(yīng)液A 和PCR 反應(yīng)液B同時(shí)進(jìn)行FQ?PCR 檢測(cè)，兩者Ct 值相減得到ΔCt，ΔCt 絕對(duì)值大于等于純合子閾值或小于等于雜合子閾值表示對(duì)該樣品的檢測(cè)有效。若不在上述范圍內(nèi)，說(shuō)明被檢樣品的檢測(cè)無(wú)效。

1.2 臨床標(biāo)本的選擇

選擇威海市立醫(yī)院2020年1月至2021年8月收治的乙型肝炎病毒表面抗原陽(yáng)性樣本30 例、丙型肝炎HCVRNA 陽(yáng)性樣本30 例。

1.2.1 標(biāo)本處理

全血：用一次性無(wú)菌注射器抽取受檢者靜脈血2 mL，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5～10 次，使抗凝劑與靜脈血充分混合，密閉送檢。血漿：全血離心后取上層清液，標(biāo)本立即檢測(cè)或保存于-20℃待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)本檢測(cè)

使用乙肝（廣州達(dá)安基因股份有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)20173404069）、丙肝病毒檢測(cè)試劑盒（PCR?熒光探針?lè)ǎ?廣州達(dá)安基因股份有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)20153402100)，用以上各種混合酶各5 U 替代試劑盒中的反應(yīng)液B，以野生型及對(duì)應(yīng)的Taq 酶突變體為陰性對(duì)照組，對(duì)上述血液樣本進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增效能檢測(cè)

將野生型Taq 酶、混合酶、Taq 酶突變體分別應(yīng)用于上述臨床樣本進(jìn)行PCR 檢測(cè)。當(dāng)Taq 酶突變體與野生型Taq 酶按不同比例混合后，Ct 值未出現(xiàn)下降，其中個(gè)別組Ct 值反而有所增加。見(jiàn)表3、圖1。

表3 Taq 酶突變體與野生型Taq 酶、混合酶ct 值Table 3 Ct value distribution of Taq enzyme mutant and wild?type Taq enzyme and mixed enzyme

圖1 Taq 酶突變體與野生型Taq 酶、混合酶Ct 值分布Figure 1 Ct value distribution of Taq enzyme mutant and wild?type Taq enzyme and mixed enzyme

2.2 靈敏度檢測(cè)（最低檢出限及定量限）

采用梯度稀釋的方法，對(duì)臨床樣本進(jìn)行3 次重復(fù)檢測(cè)，以檢出率為100%作為最低檢出限；標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.99。見(jiàn)圖2。

圖2 樣本檢測(cè)曲線Figure 2 Sample detection curve

2.3 精密度檢測(cè)

將上述九種Taq 酶突變體進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，批內(nèi)及批間的檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值的變異系數(shù)（CV%）均小于5%。見(jiàn)表4。

表4 Taq 酶突變體重復(fù)檢測(cè)Ct 值Table 4 Taq enzyme mutant repeated detection Ct value

2.4 臨床特異性分析

應(yīng)用Taq酶突變體及野生型Taq酶對(duì)另外10份與感染部位相同或感染癥狀相似的病毒或臨床HBV、HCV 陰性樣本的其他病毒：人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）、丁型肝炎病毒（Hepatitis D Virus，HDV）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）、EB 病毒（Epstein?Barr Virus，EBV）、人巨細(xì)胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）、梅毒螺旋體（Treponema Pallidum，TP）、單純皰疹病毒1 型（Herpes Simplex Virus type?1，HSV?1）、單純皰疹病毒2 型（Herpes Simplex Virus type?2，HSV?2）、腺病毒（Adenovirus，ADV）、甲型肝炎病毒（Hepati?tis A Virus，HAV）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均測(cè)試為陰性。

3 討論

近年來(lái)，乙型肝炎及丙型肝炎屬于兩種較為普遍的傳染病，嚴(yán)重危害著人們的健康。除了普通的血清學(xué)標(biāo)志檢測(cè)方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在乙肝及丙肝的診斷、治療及愈后監(jiān)測(cè)等臨床領(lǐng)域也已逐漸廣泛應(yīng)用［7］。隨著PCR 技術(shù)不斷發(fā)展，對(duì)靈敏度、精確度及特異性等方面的要求越來(lái)越高，普通PCR 已無(wú)法完全滿足臨床標(biāo)本檢測(cè)的實(shí)際需求［8］。因此，研究通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)，從隨機(jī)突變庫(kù)中篩選出對(duì)Taq 酶活性具有高度相關(guān)性的氨基酸位點(diǎn)及突變方式，選擇其中具有協(xié)同效應(yīng)的突變位點(diǎn)，積累出最適應(yīng)所添加篩選條件的的優(yōu)勢(shì)性狀，使所得突變體數(shù)量達(dá)到定點(diǎn)突變的105倍，通過(guò)該方法得到所有突變體中的最優(yōu)個(gè)體［9?11］。本研究所得結(jié)果可見(jiàn)，特定的突變型DNA 聚合酶與野生型DNA 聚合酶相比，PCR 檢測(cè)突變組Ct 值下降，表現(xiàn)出較為優(yōu)異的PCR 擴(kuò)增效率；野生型DNA 聚合酶和特定的突變型DNA 聚合酶混合，也表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效果［9］，本研究中兩種不同類型的Taq 酶表現(xiàn)出不同的擴(kuò)增活性和PCR 性能也證明了這一點(diǎn)。同時(shí)，研究應(yīng)用Taq 酶突變體對(duì)乙肝、丙肝病毒樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，所得精密度結(jié)果符合檢測(cè)要求；且結(jié)果可在最低檢出限內(nèi)檢測(cè)出陽(yáng)性，均滿足最低檢出限要求，說(shuō)明Taq 酶突變體的應(yīng)有有效且該方法的靈敏度明顯高于野生型Taq 酶。

綜上所述，對(duì)于乙型及丙型病毒選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法進(jìn)行臨床檢測(cè)，可獲得更為顯著的測(cè)定結(jié)果。同時(shí)提高Taq 酶的DNA 聚合活性及持續(xù)延伸能力，大幅度增加了PCR 臨床檢測(cè)的擴(kuò)增效率，可為Taq 酶的性能改造指出新的方向，進(jìn)而為病毒型肝炎患者臨床治療方案的研究提供可靠依據(jù)。