劉軒辰 李潔 馬繼光

脂肪組織是理想的軟組織填充材料，目前廣泛應用于美容填充、組織重建和瘢痕治療等領域[1-5]，提高移植脂肪的存活率是相關(guān)研究的熱點問題。已有研究表明，向脂肪移植物中添加基質(zhì)血管成分[6]、脂肪干細胞（Adipose-derived stem cell,ADSCs）[7]、ADSCs 分泌的細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）[8]、富血小板血漿[9]、細胞因子[10]等，都可提高移植脂肪的存活率。其中，EVs 是近年來的研究熱點。本文擬從細胞外囊泡的定義、分離方法、移植方法及其在提高脂肪移植存活率中的作用等方面進行綜述，總結(jié)細胞外囊泡提高脂肪移植存活率的作用機制和現(xiàn)有研究的不足之處，并展望后續(xù)研究的方向。

1 定義及特點

EVs 是由細胞釋放到細胞外微環(huán)境的膜狀囊泡。血液、尿液、腦脊液、唾液、羊水、母乳等體液中均含有EVs。盡管EVs 目前指代所有的分泌囊泡，但其內(nèi)容物、大小以及膜組成實際上是高度異質(zhì)及動態(tài)變化的[11]。EVs 主要分為三類：外泌體、微囊泡及凋亡小體，這三種EVs 產(chǎn)生的機制有所不同。外泌體的形成始于細胞內(nèi)陷形成多囊泡體，多囊泡體與胞膜融合后以出芽的方式分泌到細胞外。微囊泡是細胞膜以直接向外出芽的方式向內(nèi)環(huán)境中分泌囊泡。凋亡小體是在細胞凋亡過程中產(chǎn)生的[11]。在功能上，EVs 具有運輸?shù)鞍踪|(zhì)、核酸和脂質(zhì)的能力，EVs 介導的信號轉(zhuǎn)導可以通過以上幾種生物分子進行傳遞，參與跨細胞的信息交流，從而影響分泌細胞以及受體細胞的各種生理、病理活動[12]。

在電子顯微鏡下，ADSCs 分泌的EVs 大多呈杯形或球形，為脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，直徑為50～1 000 nm，平均電位在-16.68 mV 左右,高表達CD9、CD63、CD81、TSG101，低表達3-磷酸甘油醛脫氫酶、鈣聯(lián)蛋白[8,13-16]。其中,外泌體為兩面凹陷的圓盤形或杯形，直徑大多在20～400 nm，大多數(shù)粒徑小于200 nm，表面標志物包括CD9、CD63、CD81、TSG101、β-actin 等[17-21]。

2 分離及輔助移植方法

吸脂手術(shù)獲得的脂肪組織中含有豐富的EVs[8]。EVs 的分離是關(guān)鍵步驟，分離方法包括差速離心法、密度梯度離心法、免疫吸附法、沉淀法、超濾法和凝膠滲透色譜法等[22]。其中，最常使用的是差速離心法，即將脂肪抽吸液中的液體成分采取逐漸提高離心速度的方法進行分離。起始的離心速度較低，將較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集上清液，改用較高的離心速度離心上清液，將較小的EVs 顆粒沉降，以達到分離EVs 的目的[8]。EVs 輔助脂肪移植的操作方法主要有兩種：一種是將脂肪顆粒注射到皮下，再將外泌體注射入靜脈中[20]；另一種是將脂肪顆粒與EVs 混合后再進行移植[8,13,16]。

3 EVs 提高脂肪移植存活率

EVs 與脂肪混合移植后移植物體積、濕重均顯著高于單純脂肪移植組[13,16,19]。然而，有研究表明，術(shù)后2 周富含EVs的移植物體積留存率與單純脂肪移植組之間沒有統(tǒng)計學差異；在第4 周、8 周時兩組體積留存率才有統(tǒng)計學差異，提示EVs 的作用具有一定的時間依賴性[23]。除了提高脂肪移植存活率，EVs 還有助于維持脂肪結(jié)構(gòu)完整性。對添加外泌體的移植物和單純脂肪移植物切片進行脂滴包被蛋白（活體人類脂肪細胞的標志物）染色，添加外泌體的移植物切片中脂滴包被蛋白陽性的脂肪細胞數(shù)量多于單純脂肪移植組[13,17]。

4 EVs 提高脂肪移植存活率的機制

4.1 促進血管生成

4.1.1 促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移及管狀形成

由于移植物的血運局限于移植組織的外周區(qū)域，而中央?yún)^(qū)域缺少營養(yǎng)和氧氣，導致脂肪細胞與干細胞凋亡，從而使得移植后脂肪體積逐漸減小。因此，提高移植物受區(qū)血運有助于提高脂肪移植存活率[20]。激光多普勒血流檢測儀檢測到添加外泌體的移植物周圍微循環(huán)血液灌注增加，而不含外泌體的移植物表面血管化相對較差[17]。

EVs 可促進血管生成。血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移是血管生成的基礎。造血干細胞/祖細胞和內(nèi)皮細胞均表達CD34[24]，使用CD34 抗體對組織切片進行免疫組化染色可發(fā)現(xiàn)添加EVs 的移植物CD34 表達明顯增加，表明移植物中毛細血管數(shù)量增加[16]。CD31 是內(nèi)皮細胞及其祖細胞的經(jīng)典標志物[24]，對脂肪移植物切片進行CD31 免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)添加EVs 的移植物中CD31 表達增加，表明毛細血管密度升高[14-15,17-20]。此外，EVs 輔助移植組Ki67+細胞含量增加，提示內(nèi)皮細胞增殖能力增強[13,16]。通過細胞劃痕實驗評估EVs 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）遷移速度的影響，在培養(yǎng)基中添加EVs 后觀察到hUVECs 的遷移速度在第12、24 小時顯著增加，表明EVs 可加速HUVECs 遷移[8,17]。

ADSCs 分泌的EVs 可促進hUVECs 管狀結(jié)構(gòu)形成，表現(xiàn)為hUVECs 與EVs 共同培養(yǎng)后，hUVECs 管狀結(jié)構(gòu)的長度及數(shù)量顯著增加[8,13]。在培養(yǎng)基中添加外泌體12 h 后，hUVECs的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量達到峰值，表明外泌體的影響可能具有一定時間依賴性，外泌體轉(zhuǎn)運的促進血管生成的蛋白與脂肪細胞接觸后發(fā)揮作用，12 h 后可能會被滅活[18]。Nie 等[23]比較了濃度為0、25、50、100 μg/mL 的富含EVs 的脫細胞脂肪組織凝膠，發(fā)現(xiàn)50 μg/mL 的EVs 促進管狀形成的能力最強，繼續(xù)增大EVs 劑量并不能進一步增強EVs 促進血管內(nèi)皮細胞生成的能力，提示EVs 的作用具有一定的濃度依賴性。

4.1.2 提高促血管生成因子表達

EVs 可通過促進血管生成相關(guān)基因的表達及蛋白質(zhì)的分泌而發(fā)揮作用。qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，外泌體可以上調(diào)血管生成素-1 和酪氨酸蛋白激酶受體-1 的mRNA 的表達[18]。EVs通過上調(diào)let-7 家族的表達，抑制argonaute1 的mRNA 表達，最終增加了血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的mRNA 表達[15]。EVs 中所含的蛋白質(zhì)、肽類也可促進血管生成。外泌體輔助移植可提高移植物中30 多種生長因子的表達，包括VEGF、肝細胞生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血管生成素、酪氨酸蛋白激酶受體-2、單核細胞趨化蛋白、過氧化物酶體增殖物活化受體γ、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白-β 等[18]。VEGF 是內(nèi)皮細胞特有的血管生成因子[25]，VEGF/VEGF-R 信號在調(diào)控新生血管形成中起關(guān)鍵作用，如誘導基因表達、調(diào)節(jié)血管通透性、促進細胞遷移、增殖和存活[26]。研究發(fā)現(xiàn)，添加外泌體的移植脂肪中VEGF-R 表達均高于單純脂肪移植組，表明VEGF/VEGF-R 參與了外泌體介導的體內(nèi)血管生成[16,18]。

4.2 調(diào)節(jié)炎癥反應

除了促進移植物早期血運重建外，EVs 還可以減輕脂肪移植物中的炎癥反應。組織學分析發(fā)現(xiàn)，EVs 輔助脂肪移植組的脂肪形態(tài)更完整、細胞分布更均勻；而單純脂肪移植組中脂肪組織出現(xiàn)更多的壞死、纖維化及炎癥浸潤[13]。單純脂肪移植15 d 后可見炎性細胞浸潤和組織壞死；然而在添加外泌體的移植物中直到30 d 后才出現(xiàn)這些病理變化，并且壞死的程度較輕[18]。

EVs 可通過促進巨噬細胞的極化上調(diào)M2 型巨噬細胞的表達，繼而促進脂肪移植物血管生成并提高脂肪移植存活率。巨噬細胞分為M1 和M2 兩種類型，巨噬細胞的極化狀態(tài)可影響其促炎和抗炎反應：M1 型巨噬細胞是具有病原體殺傷能力的促炎表型，M2 型巨噬細胞是具有促進細胞增殖和組織修復的抗炎表型[27]。被攝取到巨噬細胞中的EVs 可誘導M2 型巨噬細胞的極化。將添加EVs 的移植物切片進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)移植物外周及中心區(qū)域F4/80+、CD206+的M2型巨噬細胞密度增加；流式細胞分析也提示添加EVs 的移植物CD206+M2 型巨噬細胞比例增加，CD11c+M1 型巨噬細胞比例減少[14]。在轉(zhuǎn)錄層面，ADSCs 分泌的外泌體與巨噬細胞一同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細胞的mRNA 表達增加[20]。巨噬細胞極化的機制還未完全闡明，有研究提出ADSCs 分泌的外泌體通過分泌let-7c，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白-δ 表達水平，導致M2 巨噬細胞分化增加，M1 型巨噬細胞分化減少[20]。分別將生理鹽水和M2 型巨噬細胞與移植物混合后移植到小鼠頭皮下，移植3 個月后發(fā)現(xiàn)添加M2 型巨噬細胞的移植物與添加生理鹽水的移植物相比，血管密度增加了157%，且添加M2 型巨噬細胞的移植物體積約為添加生理鹽水移植物的2.6 倍，表明M2 型巨噬細胞可促進移植物新生血管生成并提高自體脂肪移植存活率[28]。

5 總結(jié)與展望

EVs 中豐富的蛋白質(zhì)及核酸組成可調(diào)節(jié)血管生成、內(nèi)皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞遷移等，最終提高了移植脂肪的存活率[8]。EVs 作為一種新型納米材料已被廣泛應用于不同領域，但是在應用EVs 的過程中尚存在許多問題。首先，EVs 的來源有限，EVs 的產(chǎn)量成為研究的限速步驟。可通過3D 細胞培養(yǎng)技術(shù)擴增細胞，或者是改良提取技術(shù)，在提取EVs 的過程中盡可能減少損失[16,21]。其次，從脂肪抽吸液中提取的EVs 是混合物，分析EVs 的具體成分有助于進一步了解EVs 對脂肪存活率的影響[8]。再次，由于EVs 在組織中壽命很短，限制了其在實際臨床工作中的應用，與單次使用總量相同的EVs 相比，多次定時添加EVs 可以更好地提高脂肪移植存活率[8,29]。此外，獲取外泌體的過程十分復雜，目前已有去除白細胞的純化外泌體產(chǎn)品，可避免同種異體的免疫排斥反應；并且該產(chǎn)品可在室溫下存放一年，便于運輸和保存[30]。目前EVs 輔助脂肪移植的體內(nèi)研究僅限于動物實驗，待臨床應用推廣還有很長的距離。隨著EVs 輔助脂肪移植研究的不斷進展，EVs有望成為提高脂肪移植存活率的理想方法。