楊曉華 何樂人

近年來應(yīng)用骨組織工程修復(fù)骨缺損已取得一定的臨床進展，目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞仍是骨組織工程最常用的干細(xì)胞來源，但存在以下缺點：獲取時需對供體進行侵入性操作，不僅創(chuàng)傷大[1-2]，獲得的干細(xì)胞少[3-4]，而且供體年齡會影響干細(xì)胞的成骨分化能力[5-6]。脂肪來源干細(xì)胞具有多向分化的潛能，且來源廣泛，獲取相對容易[3]，所以脂肪干細(xì)胞具有一定優(yōu)勢。

但吸脂術(shù)要求具有一定厚度的皮下脂肪，且術(shù)后常常存在血腫、硬結(jié)、感覺異常等并發(fā)癥。頰脂墊是位于頰肌和咬肌之間的一團具有完整包膜的脂肪組織，位置固定，體積與年齡、性別、體重?zé)o明顯相關(guān)性，個體差異小。因易于從口腔內(nèi)獲取，血供豐富，具有一定體積，已被廣泛用于口腔和頜面整形修復(fù)手術(shù)中[7-8]。

研究發(fā)現(xiàn)頰脂墊中存在具有成骨分化能力的干細(xì)胞。本文對頰脂墊來源干細(xì)胞的研究應(yīng)用進展進行綜述，總結(jié)其成骨能力和誘導(dǎo)新生骨的潛在優(yōu)勢，為骨組織工程種子細(xì)胞來源提供參考。

1 頰脂墊干細(xì)胞和誘導(dǎo)成骨分化

20 世紀(jì)80 年代發(fā)現(xiàn)脂肪組織中存在干細(xì)胞以來，獲取皮下脂肪干細(xì)胞的實驗方法是經(jīng)過膠原酶消化、過濾、離心除去成熟脂肪細(xì)胞后，得到基質(zhì)血管組分（SVF），該組分是包含脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose stromal/stem cell，ASC）、內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、周細(xì)胞在內(nèi)的異質(zhì)性成分[9]。2006 年，Pyo 等[10]將該實驗方法用于頰脂墊，獲取的細(xì)胞濾液傳代培養(yǎng)，取第3 代細(xì)胞，免疫熒光實驗示該細(xì)胞群表面標(biāo)志物CD34-、CD105+、STRO1+，繼續(xù)培養(yǎng)并分別接種于普通培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的細(xì)胞在第14、21 天ALP 活性顯著升高，茜素紅濃染，第21 天RT-PCR 檢測到OC 基因的表達。該實驗證實頰脂墊中也存在干細(xì)胞，并且可以分化成骨。2010 年，F(xiàn)arre′-Guasch 等[11]運用相同的分離方法得到頰脂墊中的間充質(zhì)干細(xì)胞（BFP-ASC），陽性對照采用皮下脂肪干細(xì)胞（SC-ASC），經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后兩種脂肪細(xì)胞形態(tài)相似，都表達CD73、CD90、CD105，不表達CD45、CD19、CD14、HLADR，ALP 水平在第7天后開始上升，2 周后茜素紅染色濃染，成骨相關(guān)基因表達增加。該實驗證實在合適的誘導(dǎo)條件下，頰脂墊中的基質(zhì)血管組分含有的干細(xì)胞能向骨組織細(xì)胞分化。

2 頰脂墊干細(xì)胞特性和成骨分化能力

Farré-Guasch 等[11]觀察到，在培養(yǎng)的第2～4 天BFP-ASC保持靜止?fàn)顟B(tài)，之后快速生長分裂至融合狀態(tài)，呈單層大扁平細(xì)胞樣，培養(yǎng)7 d 后，BPF-ASC 的形態(tài)變成成纖維細(xì)胞樣的紡錘型，這是間充質(zhì)干細(xì)胞的典型形態(tài)。Broccaioli 等[12]、Niada等[13]之后的研究也都觀察到，不論是取自人還是豬的頰脂墊，大概在傳代培養(yǎng)至第7 天，BFP-ASC 會變成紡錘型細(xì)胞。

通常對傳代培養(yǎng)至第2～4 代的細(xì)胞進行流式細(xì)胞學(xué)分析，大部分體外試驗[11-12，14]都發(fā)現(xiàn)人BFP-ASC 表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物：CD105、CD73、CD29、CD90、CD44，極少量甚至不表達 造血系細(xì)胞表面標(biāo)志[13]：CD45、CD19、CD14、HLADR、CD34、CD31、CD146 是血管內(nèi)皮細(xì)胞譜系的代表性標(biāo)志物，培養(yǎng)初期的BFP-ASC 能表達CD146、CD29，經(jīng)過傳代培養(yǎng)后CD146 消失。但Rezai 等[15]在第3 代BFP-ASC 中也觀察到CD146、CD34 的高表達，考慮是因為頰脂墊是富血管的脂肪組織，且微血管的存在有利于新生骨的生長[11]。Fuji maki[16]發(fā)現(xiàn)第1 代BFP-ASC 中18.6%細(xì)胞表現(xiàn)為αSMA+（肌細(xì)胞），12.8%細(xì)胞表現(xiàn)為CD45+（淋巴細(xì)胞），13.3%細(xì)胞表現(xiàn)為CD11b+（單核細(xì)胞），進一步證實了從SVF 中分離的BFP-ASC 是一群異質(zhì)性細(xì)胞。ASC 表面不表達免疫相關(guān)抗原[17]，如MHC-II、HLA-DR、CD40、CD40L、CD80、CD86，并且抑制自體細(xì)胞誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。

Farre′-Guasch 等[11]計數(shù)了每克脂肪組織的細(xì)胞產(chǎn)量，結(jié)果顯示每克BFP 組織細(xì)胞產(chǎn)量與每克SC 組織細(xì)胞產(chǎn)量沒有統(tǒng)計學(xué)差異；Broccaioli 等[12]從皮下組織和頰脂墊中也獲取了近似的細(xì)胞產(chǎn)量，多個實驗比較細(xì)胞倍增時間、MTT 實驗結(jié)果、成纖維細(xì)胞集落形成單位計數(shù)（Fibroblast-colony-forming unit assay，CFU-F），結(jié)果顯示SC-ASC 與BFP-ASC 結(jié)果相近，沒有統(tǒng)計學(xué)差異，表明BFP-ASC 具備脂肪干細(xì)胞的生長分裂能力[12-13]。

Farré-Guasch 等[11]觀察到培養(yǎng)1 周后，人BFP-ASC 在逐漸形成成纖維細(xì)胞的過程中，ALP 的活性逐漸升高直至第21天，第7 天的ALP 活性是初始細(xì)胞的2.5 倍，第14 天是16.5 倍。在誘導(dǎo)骨分化的第14 天，成骨基因CBFA1、骨連接素基因SPARC 的表達分別增長了8 倍、2 倍，免疫熒光顯示BFP-ASC 在骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后表達骨鈣素（Osteocalcin，OCN），BFP-ASC 在骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周后顯微鏡下見茜素紅強染色，提示細(xì)胞外基質(zhì)的鈣沉積顯著。對豬BFP-ASC 和SC-ASC 的研究表明，兩組ASC 都在骨誘導(dǎo)分化后高表達膠原蛋白、鈣化沉積的細(xì)胞外基質(zhì)、骨連接素和高活性ALP[18]。

3 頰脂墊去分化脂肪干細(xì)胞（DFAT）與頰脂墊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

頰脂墊主要由成熟脂肪組織和基質(zhì)血管組分（SVF）構(gòu)成，在證實了SVF 中存在干細(xì)胞后，分離出成熟脂肪細(xì)胞，通過天花板培養(yǎng)法從中獲取去分化脂肪細(xì)胞（Dedifferentiated fat cell，DFAT），顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，成熟脂肪細(xì)胞通過脫去脂滴形成紡錘型的DFAT，在合適的骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)能分化出骨組織。Kishimoto 等[19]從同一人體的頰脂墊中分化出ASC 和DFAT，并將兩者進行比較研究。在培養(yǎng)的第3 天，BFP-ASC 的DNA 含量明顯高于DFAT，但在第7、14天時兩者沒有顯著差異，兩者增殖能力相似，都表達CD90、CD105，不表達CD11b、CD34、CD45，但經(jīng)過成骨誘導(dǎo)的DFAT 中DNA 含量、BAP、OCN、鈣分布都顯著高于ASC。成骨誘導(dǎo)第14 天，DFAT 的礦化結(jié)節(jié)和茜素紅染色較ASC 明顯，顯示DFAT 的骨分化能力高于ASC。

對DFAT 的研究還包括成脂傾向和細(xì)胞直徑。Kou 等[20]從人BFP 中分離出DFAT 后分別進行骨誘導(dǎo)和脂肪誘導(dǎo)分化，DFAT 細(xì)胞表面表達CD13、CD29、CD105、CD44，不表達CD31、CD34、CD309、CD106 和α-SMA，盡管將骨誘導(dǎo)分化的時間延長至3 周，DFAT 細(xì)胞外基質(zhì)茜素紅染色仍有限，且相當(dāng)大比例的細(xì)胞呈多邊形、油紅O 濃染，提示DFAT 細(xì)胞的脂肪分化能力可能強于骨分化能力，這也許和DFAT 本身來源于脂肪組織有關(guān)。Tsurumachi 等[18]以成熟脂肪細(xì)胞直徑40 μm 為界，研究大、小脂肪細(xì)胞去分化為DFAT 細(xì)胞的差異，結(jié)果大DFAT、小DFAT 都高表達CD13、CD90、CD73、CD105、CD44，增殖能力沒有差異，但S-DFAT 多向分化相關(guān)基因表達水平更高，ALP 活性、茜素紅染色、鈣分布更多。該研究還發(fā)現(xiàn)，小DFAT 在1 周的傳代培養(yǎng)后逐漸在細(xì)胞表面表達CD146，且表達水平大于大DFAT，之前的研究中DFAT表面不表達CD146，認(rèn)為這是因為DFAT 在傳代培養(yǎng)的過程中逐漸獲得周細(xì)胞的特征。

4 頰脂墊間充質(zhì)干細(xì)胞與皮下脂肪干細(xì)胞的對比

體外試驗表明，頰脂墊間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力、成骨分化能力與皮下脂肪干細(xì)胞相當(dāng)。張圣敏等[21]分別提取面部輪廓整形手術(shù)中獲取的人頰脂墊和吸脂術(shù)獲取的皮下脂肪，分別進行體外傳代培養(yǎng)與成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)兩種干細(xì)胞形態(tài)差異不大，均表達CD44，不表達CD34，但頰脂墊細(xì)胞產(chǎn)量高于皮下脂肪，ALP 水平也顯著高于皮下脂肪，表明頰脂墊含有的脂肪干細(xì)胞生物學(xué)活性優(yōu)于吸脂術(shù)皮下脂肪。Broccaioli等[12]的研究表明，上述兩種脂肪干細(xì)胞都表達CD73、CD90、CD105，不表達CD34、CD31、CD14，細(xì)胞形態(tài)、增殖速度、細(xì)胞產(chǎn)量無顯著差異，ALP 活性和膠原分布都顯著上調(diào)。該研究顯示，SC-ASC 表現(xiàn)為高度特異性的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞之間形態(tài)同質(zhì)性高，BFP-ASC 相較之下同質(zhì)性低，且細(xì)胞更小更圓。Niada 等[13]從豬身上獲取頰脂墊和皮下脂肪，兩種干細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)量、形態(tài)、倍增時間、細(xì)胞活性相似，傳代培養(yǎng)至第1～4 代都表現(xiàn)出良好的集落形成能力，都表達CD90，不表達CD271、CD14、CD45、CD73、CD105，膠原、鈣化細(xì)胞外基質(zhì)、ALP 活性、黏骨素表達都增加。考慮到頰脂墊組織采集量較少，認(rèn)為頰脂墊脂肪干細(xì)胞的成骨能力優(yōu)于一般皮下脂肪。Rezai 等[15]對比頰脂墊干細(xì)胞（BFPdSCs）、腹部脂肪干細(xì)胞（AbdSCs）、臀部脂肪干細(xì)胞（HdSCs）的干細(xì)胞特性，結(jié)果三種干細(xì)胞都高表達CD90、CD73、CD105、CD44，不表達CD34、CD45，BFPdSCs 中小部分細(xì)胞表達CD34、CD146，在低代細(xì)胞系，BFPdSCs 增殖速度更快、倍增時間更短。基于之前的研究，細(xì)胞傳代培養(yǎng)代數(shù)會影響多向分化的能力，基因突變、細(xì)胞癌變、細(xì)胞凋亡和細(xì)菌污染的風(fēng)險升高，因此認(rèn)為干細(xì)胞療法最好取用低代次的干細(xì)胞，安全性更好。成骨能力方面，在該實驗中，在第7、14 天，BFP-ASC 的ALP、BMP2（早期成骨相關(guān)標(biāo)志物）表達水平更高，第14 天時BFP-ASC 的RUNX2 表達水平明顯更高。

5 頰脂墊間充質(zhì)干細(xì)胞與其他干細(xì)胞的對比

Ghaderi 等[22]發(fā)現(xiàn)頰脂墊干細(xì)胞（BFP-MSCs）、牙槽干細(xì)胞（GDCs）都表達CD166、CD90、CD73、CD105、CD44，不表達CD34、CD45、CD14，但BFP-MSCs 鈣化結(jié)節(jié)分布更多，成骨相關(guān)基因BGLA、BMP2 轉(zhuǎn)錄水平更高。相較于牙槽干細(xì)胞，頰脂墊干細(xì)胞是更優(yōu)良的組織工程種子細(xì)胞。Genova 等[23]對比頰脂墊干細(xì)胞（BFPSCs）、牙髓干細(xì)胞（DPSCs），兩種干細(xì)胞都能分化出骨樣細(xì)胞、分泌鈣化基質(zhì)，但BFPSCs 細(xì)胞產(chǎn)量、增殖水平更高，雖然骨鈣素釋放也更高，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

6 誘導(dǎo)頰脂墊干細(xì)胞成骨分化的因素研究

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是能誘發(fā)異位性骨生成的轉(zhuǎn)化生長因子之一，是常見的骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加劑。Kim 等[24]研究BMP 濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）對成骨分化的影響，結(jié)果顯示50 ng/mL 以上的培養(yǎng)基中能在第14 天觀察到ALP 染色、茜素紅染色，第21 天染色加深，其中100 ng/mL 染色最深，第21 天各組均表達骨鈣素，骨鈣素的表達與BMP2 濃度相關(guān)，BMP2 超過100 ng/mL 骨鈣素表達下降。研究指出，誘導(dǎo)頰脂墊干細(xì)胞成骨分化的BMP2 濃度至少應(yīng)大于50 ng/mL。Shiraishi 等[14]將添加了BMP 的培養(yǎng)基與骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Osteoinductive reagents，OSR）對比，BMP 組ALP 水平顯著高于其他組，BMP 組、BMP+OS 組茜素紅染色顯著，成骨基因runx2、ocn、opn 表達顯著上調(diào)，BMP 能誘導(dǎo)頰脂墊干細(xì)胞成骨分化。

Nagasaki 等[25]發(fā)現(xiàn)，低強度脈沖超聲（LIPUS）聯(lián)合納米羥基磷灰石（NHA）處理的頰脂墊干細(xì)胞ALP 活性更高，茜素紅濃染，成骨相關(guān)基因表達更多，證明LIPUS 處理和NHA 支架能協(xié)同促進頰脂墊干細(xì)胞成骨分化。

Shekarchi 等[26]研究雷奈酸鍶對頰脂墊干細(xì)胞的成牙質(zhì)骨誘導(dǎo)作用，濃度梯度為0、6、12.5、25、50、100 和200 μmol/L，結(jié)果100 μmol/L 組鈣化水平最高，50、100 μmol/L 組頰脂墊干細(xì)胞成牙骨質(zhì)蛋白表達水平最高，100 μmol/L 組ALP 水平最高，200 μmol/L 組OCN 水平最高。研究認(rèn)為雷奈酸鍶可上調(diào)BFPSCs 成牙骨質(zhì)基因，誘導(dǎo)成牙骨質(zhì)分化，并有劑量依賴性，可用于改善正畸治療后的牙根吸收。

7 支架作用

Broccaioli 等[12]的研究顯示，BFP-ASC 與釉原蛋白（Amelogenin，AM）混合培養(yǎng)1 周后接種在膠原蛋白膜和聚羥基乙酸上，都表現(xiàn)出高ALP 活性和廣泛的膠原蛋白分布，這兩種生物材料都具有良好的生物相容性，掃描電子顯微鏡觀察也表明BFP-ASC 能較好地黏附于膠原蛋白膜和聚羥基乙酸上。Ardeshirylajimi 等[27]構(gòu)造了被覆Bio-oss 骨粉的聚乳酸納米支架，接種BFP-ASC 后，細(xì)胞黏附良好，與對照組相比，高表達干細(xì)胞標(biāo)志物（CD40、CD90、CD105），ALP 活性高，茜素紅濃染，鈣沉積增多，證實了該支架良好地模擬了骨組織的細(xì)胞外環(huán)境，起到良好的支撐細(xì)胞和促進生長的作用。Shiraishi 等[14]在體外證實了重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）對BFP-ASC 的骨形成誘導(dǎo)作用后。Bastami 等[28]通過構(gòu)建混合殼聚糖納米顆粒的磷酸三鈣（TCP）/明膠支架，證實了該支架具有緩慢釋放BMP2 的作用，并加強了對BFP-ASC 的骨誘導(dǎo)作用。Golchin 等[29]將姜黃素混入殼聚糖/聚羥基乙酸納米支架中，體外試驗證實支架具有良好的生物支撐性能，接種于上的BFP-ASC 成骨分化良好。羥基磷灰石能促進BFP-ASC 成骨[25]，有研究將生物陶瓷納米羥基磷灰石涂抹于聚己內(nèi)酯（PCL）支架上，構(gòu)建PCL-Bio 支架[30]，種植的BMSC、BFP-ASC 都能良好生長和進行成骨分化。但Rezai 等[31]的實驗中，在被覆膠原蛋白的羥基磷灰石/β-TCP3D 打印支架上比較誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和BFP-ASC 的成骨潛能，發(fā)現(xiàn)該支架對ASC 沒有誘導(dǎo)成骨作用。研究顯示，明膠-羥基磷灰石/氧化石墨烯支架能持續(xù)釋放維生素D[32]，有利于BFP-ASC 的生長和分化。目前，大部分的支架實驗都證實了對頰脂墊間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨和支持作用，聯(lián)合應(yīng)用支架和干細(xì)胞誘導(dǎo)體內(nèi)成骨是修復(fù)骨缺損的趨勢，但還需要更多的體內(nèi)試驗數(shù)據(jù)支持。

8 臨床試驗

已有研究將頰脂墊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床試驗，從目前的報道來看，BFP-ASC 能在人頜面骨中良好地誘導(dǎo)產(chǎn)生新生骨組織。Khojasteh 等[33]在8 個巨大頜骨萎縮的患者中進行控制對照試驗，觀察BFP-ASC 對牙槽嵴的修復(fù)效果。對照組將前髂嵴骨移植入牙槽骨缺損部位，填充凍干骨顆粒生物支架并覆蓋膠原蛋白膜，實驗組的凍干骨顆粒在填充前種植BFP-ASC，術(shù)后5 個月時進行臨床效果評估?；顧z顯示，新生骨融入并生成了類骨基質(zhì)，新生骨比例在對照組中為49.21%，試驗組為65.32%。自體髂骨移植同時滿足了骨髓干細(xì)胞和機械支撐的移植條件，但術(shù)后骨質(zhì)吸收率高，1 年后的骨質(zhì)吸收率在35%～51%。Khojasteh 等[33]認(rèn)為添加BFP-ASC能輔助骨組織再生，聯(lián)合自體髂骨移植能減少術(shù)區(qū)骨質(zhì)吸收。Khojasteh 等[34]進行前瞻性隨機臨床試驗，發(fā)現(xiàn)髂前嵴聯(lián)合BFP-ASC 能促進牙槽突裂骨缺損區(qū)新生骨重建，側(cè)支皮質(zhì)骨板對支架上的干細(xì)胞有機械保護作用。Khojasteh 等[35]從14 例下頜骨萎縮患者中采集BFP-ASC，分別將BFP-ASC 和自體骨顆粒與牛骨礦物支架以1∶1 的比例混合，術(shù)區(qū)覆蓋鈦網(wǎng)支撐固定，術(shù)后6 個月利用錐形線束計算機體層成像（Cone beam computed tomography，CBCT）評估下頜骨體積增量，結(jié)果顯示兩組水平方向和垂直方向的骨體積增加沒有顯著差異，頰脂墊也許能取代自體骨顆粒作為移植供點，減少手術(shù)創(chuàng)傷和術(shù)后并發(fā)癥。Meshram 等[36]從5 例頜骨缺損患者中采集頰脂墊組織，體外擴增培養(yǎng)得到的BFP-ASC 直接逐滴加入骨缺損區(qū)，影像學(xué)評估顯示術(shù)后1 個月所有患者術(shù)區(qū)出現(xiàn)不規(guī)則的骨小梁，接下來的3～6 個月逐漸被致密骨取代，證實BFP-ASC 對頜骨2 cm×4 cm 左右缺損的臨床修復(fù)能力。Meshram 認(rèn)為，考慮到BFP-ASC 的成骨能力和效率，避免聯(lián)合生物支架應(yīng)用于骨組織工程，能減少宿主對合成高分子材料的免疫排斥反應(yīng)。Khojasteh 等[33]將BFP-ASC 接種于天然牛骨礦物材料上，移植人體后6 個月后修復(fù)了2 例巨大牙槽骨缺損，隨后進行牙種植術(shù)，術(shù)后10 個月種植體生長良好。Akhlaghi 等[37]則將BFP-ASC 接種于人羊膜上，修復(fù)了5 例下頜骨缺損。

9 結(jié)論

大量的研究證明，頰脂墊含有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，獲取方便、創(chuàng)傷小，干細(xì)胞產(chǎn)量大，成骨誘導(dǎo)分化能力明確，頰脂墊干細(xì)胞表達血管形成標(biāo)志物，微血管的存在更有利于新生骨長入，是良好的干細(xì)胞組織供材。頰脂墊干細(xì)胞與皮下脂肪干細(xì)胞相比，兩者的成骨分化能力相當(dāng)，對于皮下脂肪菲薄、不宜進行吸脂術(shù)的患者是另一種可供參考的選擇。但要將頰脂墊干細(xì)胞應(yīng)用于臨床仍需進一步評估頰脂墊的實用性。目前頰脂墊干細(xì)胞的臨床研究集中于骨組織工程，基礎(chǔ)實驗也研究了頰脂墊干細(xì)胞的軟骨分化能力，為組織工程軟骨移植提供了新思路。