李 錚 楊 靜 焦麗麗 李 慧 吳 巍

(1. 長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130000；2. 通化吉通藥業(yè)有限公司，吉林 通化 134000)

蜂王漿(Royal Jelly，RJ)，又名蜂皇漿、皇漿，是工蜂咽腺分泌的一種漿狀物質[1]，具有抗衰老[2-3]、調節(jié)生育[4]、調節(jié)內分泌系統(tǒng)[5]等功效。在蜂王漿中除水分、蛋白質、碳水化合物、脂類(脂肪酸)等成分外[6]，還存在一類小分子化合物甾體激素，這類化合物對人體的功能調節(jié)具有十分重要的作用[7]。

甾體激素又稱類固醇激素，是一類四環(huán)脂肪烴化合物，其母核為環(huán)戊烷多氫菲。已有研究表明在RJ中存在多種甾體激素，如雌二醇[8-11]、雌三醇[8-9]、雌酮[8-9,12]、孕酮[10,12]、睪酮[10-11]、糖皮質激素[13-15]等。這些甾體激素在膽固醇和脂肪酸的代謝[16-17]、抑制早期肝癌發(fā)展[18]、降低冠心病發(fā)病率[19]、降低子宮出血和子宮內膜癌風險[20-21]等過程中起到關鍵作用。但甾體激素是RJ中的痕量激素，提取難度大，因此鮮有關于RJ甾體激素檢測的研究報道。文章擬綜述國內外關于RJ甾體激素檢測技術的研究現(xiàn)狀，以期為構建一種簡便、快捷、準確應用于檢測RJ甾體激素的方法提供理論支撐。

1 RJ中甾體激素檢測前處理方法

目前有關RJ中甾體激素的前處理并沒有特殊方法，以常規(guī)激素類成分前處理方法為主。激素類成分常用的前處理方法為：液液萃取法[22-23]、固相萃取法[24]、QuEChERS[25-26]、微波輔助萃取法[27]、固相微萃取法[28]等，前3種方法在RJ甾體激素的提取中應用較多。

1.1 液液萃取法

曹均等[10]將RJ用少量水進行水解后，加入無水乙醇萃取，可得到雌二醇、睪酮、孕酮3種甾體激素。Sidor等[11]將RJ用適量蒸餾水溶解后，在組織勻漿器中(15 000 r/min)勻漿2 min, 4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，上清液用0.45 μm尼龍注射器過濾，4 ℃保存。采用液液萃取法操作簡便、處理樣品量大，但該法耗時較長、有機溶劑消耗量大[29-30]。

1.2 固相萃取法

王強[9]在提取RJ中雌激素時，以乙酸鈉溶液作為緩沖液，乙腈、乙酸乙酯作為提取液，隨后用Oasis HLB小柱和Bond Elut-NH2小柱進行連續(xù)凈化，二氯甲烷—甲醇為洗脫液，可得到雌二醇、雌三醇、雌酮等雌激素。Ma等[12]在研究中用固相萃取法對蜂蜜中的雌激素進行提取，用試劑將樣品溶解后在HLB柱上上樣，以乙酸甲醇混合液淋洗，10%甲醇—乙酸乙酯、甲醇—氨水洗脫，洗脫液吹干后復溶，可得到雌酮、孕酮。劉素琴等[13]采用固相萃取法對蜂蜜中的雌激素進行提取，將HLB柱活化上樣后，用10%甲醇水、10%甲醇氨水、20%四氫呋喃水進行淋洗，洗脫液吹干復溶，可得到雌酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、己烷雌酚和雙酚A 6種雌激素。錢艷等[14]將RJ經乙酸銨緩沖溶液、β-葡萄糖醛酸苷酶、甲醇等溶劑溶解處理后，HLB柱吸附，適當比例甲醇、水淋洗后，甲醇洗脫，洗脫液過氨基柱，得到氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍等7種糖皮質激素。固相萃取法的有機溶劑消耗少，既可做到富集又可除雜，但該法缺乏專屬性與專一性。

分子印跡技術(MIT)是固相萃取方法之一，以某一特定的所需分子為模板分子，制備具有高選擇性聚合物[31]。Dong等[32]將模板分子與功能單體甲基丙烯酸、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸及引發(fā)劑偶氮二異丁腈混合后采用紫外光照法引發(fā)聚合，制得的分子印跡聚合物可用于污水中的雌激素的檢測。采用紫外光照法制備的分子印跡聚合物均能夠從污水、牛奶、肉制品中檢測出雌激素，且濃度范圍內線性良好，可應用于實際檢測中[33-35]。區(qū)別于其他固相萃取法，MIT具有良好的機械強度和熱穩(wěn)定性、耐酸堿性、專屬性、專一性，非常適合分離富集復雜樣品中痕量成分。目前，該技術已被廣泛應用于中藥研究的部分領域，主要包括中藥中有效成分的提取分離、凈化富集、成分測定及活性成分篩選等方面[36-37]。綜上，該技術可應用于RJ中甾體激素的檢測。

1.3 QuEChERS法

QuEChERS是一種以基質固相分散為基礎的快速樣品處理技術，該技術操作簡單，目前在農殘檢測中較為常用[38-39]。張文文[8]將RJ溶于乙酸鋅溶液以沉淀蛋白，用適量乙腈、二氯甲烷萃取上清液，隨后加入鹽包Na2SO4，PSA作為凈化材料去除RJ中極性物質，以丹磺酰氯—丙酮溶液作為衍生化試劑，得到雌二醇、雌三醇、雌酮。李璐等[15]采用QuEChERS技術對蜂蜜中的糖皮質激素進行提取。以乙腈作為提取溶劑，PSA、C18作為固相萃取劑，獲得甲基潑尼松龍等糖皮質激素。該法回收率高、準確度高、溶劑消耗少，但凈化效果較差且缺乏專一性。

1.4 其他方法

微波輔助萃取法具有溶劑消耗少、萃取時間短、有機物完全分解、樣品提取多等優(yōu)點[40]。Hibberd等[41]采用該法對河流沉積物中的雌激素進行萃取，首先以甲醇為萃取劑并進行微波加熱，隨后采用固相萃取法凈化樣品，最后進行衍生化，成功得到雌酮、雌二醇、雌三醇。該法需要對樣品進行加熱，但RJ受熱易分解，因此該法尚未應用于RJ前處理。

固相微萃取法比固相萃取法所需樣品量更小，溶劑消耗量更少，并且可達到集分離、濃縮、進樣于一體的效果[42]。姚鍵梅等[43]通過衍生瓜環(huán)固相微萃取攪拌棒法結合HPLC-UV可檢測出動物源性食品中“痕量”雌激素。鄧鑫雨等[44]制備MIL-101(Cr)填充針頭式過濾器并結合HPLC-FLD對水中雌激素進行分離富集，在試驗范圍內線性良好。目前微波輔助萃取法和固相微萃取法均未見應用于RJ中甾體激素的檢測，因此可進一步研究這兩種方法應用于RJ甾體激素檢測的可能性。

綜上，在RJ前處理過程中，液液萃取法一般以乙酸鈉、乙酸銨為緩沖溶劑，乙腈為萃取劑，固相萃取法一般選用HLB小柱吸附，淋洗液多選用甲醇混合溶液，洗脫液多選用甲醇—乙酸乙酯。RJ經過前處理，可獲得甾體激素，其中固相萃取法效果最佳，這是由于該法可以同時完成樣品的分離和富集，提高了檢測靈敏度，縮短預處理時間、節(jié)省溶劑且重現(xiàn)性好[45]。由此認為固相萃取法可作為提取RJ中甾體激素的前處理的最優(yōu)方法。但普通的固相萃取法仍存在缺乏專一性、回收率不高、樣品損失等問題，由此認為采用具有高專屬性、高選擇性的分子印跡技術作為前處理方法,能夠更好地提取富集目標化合物，利于檢測。

2 RJ中甾體激素檢測分析方法

目前，甾體激素的分析檢測方法包括高效液相色譜—質譜法(HPLC-MS)[46-48]、氣相色譜—質譜法(GC-MS)[49-50]、放射免疫測定法[51]、酶聯(lián)免疫吸附法[52]等。

2.1 HPLC-MS法

HPLC-MS技術具有操作簡便，耗時少等特點[53]。王強[9]采用高效液相色譜—四級桿時間飛行質譜法(HPLC-Q-TOF MS)對RJ中的雌激素進行檢測，選用C18色譜柱，以甲醇和水作為流動相進行梯度洗脫，選用ESI-作為離子源，以多反應監(jiān)測模式進行質譜掃描，該方法無衍生，最終結果顯示檢出限(LOD)為2.4～5.0 μg/kg，定量限(LOQ)為5.2～10.6 μg/kg，回收率為64.5%～86.3%。張文文[8]通過HPLC-MS/MS檢測RJ中的雌激素，選用C18色譜柱，以0.1%甲酸水和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，選用ESI+、ESI-作為離子源，以多反應監(jiān)測模式進行質譜掃描，最終結果顯示LOD為0.015～0.020 ng/kg，LOQ為0.1 ng/kg，回收率為80.7%～113.0%。在實際237批次RJ樣品中檢測出了雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇以及雌酮4種雌激素，其中17β-雌二醇檢出率最高。Ma等[12]采用超高效液相色譜—質譜法對蜂蜜中甾體激素進行檢測，色譜柱選用C18，以氨水及乙腈甲醇混合液為流動相，選用ESI-為離子源，以多反應監(jiān)測模式進行質譜掃描，結果表明該方法的LOD為0.01～0.33 μg/kg，加樣回收率為71.2%～99.7%。劉素琴等[13]采用超高效液相色譜—質譜法對蜂蜜中甾體激素進行檢測， 選用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18作為色譜柱，以氨水及乙腈甲醇混合液為流動相，選用ESI-作為離子源，以多反應監(jiān)測模式進行質譜掃描，結果表明LOD和LOQ分別為0.04～0.19 μg/kg和0.15～0.62 μg/kg,6種雌激素加標回收率為78.5%～112.9%。李璐等[15]采用超高效液相色譜—質譜法對蜂蜜中甾體激素進行檢測，選用C18色譜柱，以乙酸水(含0.1%)作為流動相，選用ESI+作為離子源，以多反應監(jiān)測模式進行質譜掃描，結果表明41種糖皮質激素LOQ為0.55～3.90 μg/kg，加樣回收率為83.9%～111.2%。錢艷等[14]采用液相色譜—質譜法對RJ進行檢測，色譜柱選用C8，流動相為乙腈和水，選用ESI+作為離子源，以多反應監(jiān)測模式進行質譜掃描，結果表明LOD均為10 μg/kg，加樣回收率為84.7%～100.0%。

2.2 GC-MS法

GC-MS具有檢測識別特異性，但需要對所檢測的樣品進行衍生化，在此過程中待測樣品可能出現(xiàn)一定量的損失[54]。王強[9]利用GC-MS分析RJ中雌激素，選用HP-5 MS石英毛細管色譜柱，載氣為高純He，恒流脫氣，選用EI作為離子源，以離子監(jiān)測模式進行質譜掃描，除上述操作外，試驗前需使用吡啶和衍生化試劑對目標產物進行衍生化，結果表明LOD為1.8～3.3 μg/kg，LOQ為5.3～7.4 μg/kg，回收率為63.5%～75.5%。

2.3 其他方法

放射免疫法(RIA)指利用同位素標記的抗原和未標記的抗原與抗體發(fā)生競爭性抑制反應，從而檢測生物體內各種物質的方法。曹均等[10]采用放射免疫法對RJ中3種雌激素(雌二醇、睪酮和孕酮)進行分析檢測，操作如下：取經過前處理包含待測物的上清液加入閃爍液一并放入閃爍儀中進行測定，三者平均含量分別為4.167，1.082，1.167 μg/kg。

酶聯(lián)免疫是基于抗原與抗體的特異性非放射性反應的方法[55]。Sidor等[11]嚴格使用酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒證明了該法可測試蜂制品中睪酮和雌二醇的活性，研究表明蜂王漿中睪酮平均含量為1.961 μg/kg，雌二醇平均含量為289.98 μg/kg。此外，Swart等[56]、Manickum等[57]均采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測出污水中含有雌酮、雌二醇、雌三醇等雌激素，且檢測限均到達0.2～5.0 ng/L，因此，酶聯(lián)免疫法是一種有效檢測雌激素的分析方法。

在采用放射免疫法時，由于不同廠家所提供的RIA試劑盒準確性會出現(xiàn)差異，且該技術操作復雜，因此該法不利于檢測[58]。酶聯(lián)免疫吸附法容易出現(xiàn)假陽性，導致定量檢測準確度降低。HPLC-MS、GC-MS等分析方法近年來較為常用，具有高靈敏度、低檢測限等優(yōu)點，但甾體激素本身具有難以揮發(fā)的特性，使用GC-MS法時在進樣前需要對樣品進行衍生化，不僅費時費力，還會在一定程度上造成樣品損失，因此HPLC-MS是最適合檢測RJ甾體激素的方法。

3 總結與展望

目前關于蜂王漿的研究較多，而甾體激素作為峰王漿中一種“痕量”成分卻鮮有人開發(fā)利用。分子印跡技術作為前處理方法能夠有效提高目標化合物富集率，高效液相色譜—質譜作為檢測手段能夠更快捷、更靈敏地檢測出目標化合物。因此，以分子印跡技術與高效液相色譜—質譜為基礎，建立出一套擁有良好方法學考察結果的分析方法或將成為接下來的研究重點。