孫海力 林文巧 李紹霄 陳恩就

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要因素，隨著EMT 進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力進(jìn)一步增強(qiáng)，最終實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[1]。microRNAs（miRNAs）作為一類短鏈非編碼RNA，通過(guò)與靶向信使RNA 的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）的專一性結(jié)合，影響靶基因表達(dá)[2]。研究表明，miRNAs 參與調(diào)控各種對(duì)細(xì)胞正常發(fā)育至關(guān)重要的生物過(guò)程[3]，某些miRNAs 已被證明可以抑制或促進(jìn)EMT[4]。例如miR-130a-3p 可通過(guò)靶向調(diào)控H19 抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT[5]；而miR-101-3p 可通過(guò)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲，抑制EMT 過(guò)程和細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。然而，miR-19a 在鼻咽癌EMT 發(fā)生過(guò)程中的作用仍有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究探討miR-19a 在鼻咽癌細(xì)胞EMT 過(guò)程中的作用，為揭示鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制提供參考證據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞 鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、SUNE-1、HNE1、58F 及人正常鼻咽上皮細(xì)胞株NP69 購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2試劑和儀器 1640 培養(yǎng)基購(gòu)于上海微科生物技術(shù)有限公司（批號(hào)P875-N10）；胎牛血清購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司（批號(hào)XC45632）；LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司（批號(hào)L3287）；miR-19a 及內(nèi)參U6 的引物和探針由廣州伯信生物公司設(shè)計(jì)；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司（批號(hào)12183555）；Takara One Step PrimeScript microRNA cDNA Synthesis Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本Takara 公司（批號(hào)D350A、DRR041A）；ECMatrix 膠和Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司（批號(hào)356234、3422）；BCA 蛋白測(cè)定試劑盒和超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自南京凱基公司（批號(hào)EW-48-63、EW-6613）；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)abcam 公司（批號(hào)ab228530）；抗E-cadherin、N-cadherin 和KRAS 抗體購(gòu)自美國(guó)abcam 公司（批號(hào) ab40772、ab76011、ab191595）；FAK、SRC 和 β -actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司（批號(hào)sc-271126、sc-166860、sc-8432）；倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司（型號(hào)：IX71）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司（型號(hào)：9600）；凝膠成像儀購(gòu)自北京廣開源商貿(mào)有限公司（型號(hào)：IAS-500）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 運(yùn)用1640 培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培育，同時(shí)在1640 培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清，細(xì)胞放置細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中，使用含EDTA 胰蛋白酶消化，按照1∶3 的比例進(jìn)行傳代。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 鼻咽癌細(xì)胞加入96 孔板中，每孔中分配2×104個(gè)細(xì)胞，完全遵循LipofectamineTM2000 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行下一步操作。實(shí)驗(yàn)分為四組：mimics NC 組：每孔SUNE-1 細(xì)胞加入100nmol 的mimics NC 及5μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-19a mimics 組：每孔SUNE-1 細(xì)胞加入100nmol 的miR-19a mimics及5μL 轉(zhuǎn)染試劑；inhibitor NC 組：每孔HNE1 細(xì)胞加入100nmol 的inhibitor NC 及5μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-19a inhibitor 組：每孔HNE1 細(xì)胞加入100nmol的miR-19a inhibitor 及5μL 轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)行熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，RT-qPCR）檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)染效率后再進(jìn)行細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)。

2.3RT-qPCR 檢測(cè)miR-19a 表達(dá) 用Trizol 試劑提取總RNA 并按照說(shuō)明操作，RNA 濃度由超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 過(guò)程完全遵循試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，設(shè)置U6 作為內(nèi)參，通過(guò)2-△△Ct法分析miR-19a 在鼻咽癌細(xì)胞中的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2.4細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 每個(gè)Transwell 上室鋪有一層ECMatrix 膠模擬體內(nèi)環(huán)境，收集鼻咽癌SUNE-1 和HNE1 細(xì)胞懸液，經(jīng)冰PBS 緩沖液洗滌3 次，并將細(xì)胞懸液的密度調(diào)節(jié)至2×105/mL，將20μL 細(xì)胞懸液加至Transwell 上室，再將500μL 的DMEM 完全培養(yǎng)基加入Transwell 下室，Transwell 小室置于37℃中孵育過(guò)夜后加入1～2 滴結(jié)晶紫試劑，反應(yīng)15min后在光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移至Transwell 小室背側(cè)的細(xì)胞，在200 倍放大視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)視野下的藍(lán)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2.5熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將重組熒光素酶報(bào)告載體mut-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 或wt-psi-CHECK-KRAS-3'-UTR 共轉(zhuǎn)染至SUNE-1 細(xì)胞中，再分別將miR-19a mimics 或mimics NC 轉(zhuǎn)染至SUNE-1 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h 后收獲細(xì)胞，樣品熒光素酶活性檢測(cè)過(guò)程完全遵循熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每組樣本設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。

2.6蛋白質(zhì)印跡法 鼻咽癌細(xì)胞在細(xì)胞裂解液的作用下提取蛋白，總蛋白經(jīng)勻漿、離心和變性等操作后，使用凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，通過(guò)脫脂奶粉進(jìn)行封閉操作，整體實(shí)驗(yàn)環(huán)境為4℃，維持12h，硝酸纖維素膜通過(guò)Ⅰ抗、Ⅱ抗反應(yīng)后，添加一定的化學(xué)發(fā)光液，完成顯色、曝光等處理。

2.7細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 收集胰蛋白酶消化后的SUNE-1 細(xì)胞以制備單細(xì)胞懸浮液，將消化好的細(xì)胞懸液密度調(diào)至3×104/mL，將0.5mL 細(xì)胞液滴加到24孔板中的多聚賴氨酸處理的細(xì)胞爬片上，藥物初步處理后放在37℃環(huán)境中12h，細(xì)胞經(jīng)PBS 清洗和甲醛固定后加入KRAS 一抗在4℃溫度下孵育12h，經(jīng)PBS 沖洗殘余一抗后加入熒光二抗在室溫下孵育1h，再次經(jīng)PBS 沖洗3 次后加入Hoechst33342 染色液在室溫下孵育5min，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。

2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖。在本實(shí)驗(yàn)中獲得的所有測(cè)量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SNKq 檢驗(yàn)分析兩個(gè)樣品之間的差異，設(shè)立P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1miR-19a 在鼻咽癌細(xì)胞系和正常鼻咽上皮細(xì)胞中的表達(dá) NP69 細(xì)胞miR-19a 表達(dá)水平分別是CNE2、SUNE-1、HNE1 和58F 細(xì)胞的5.88、3.57、11.11 和6.67 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.01）。miR-19a 在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HNE1 和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SUNE-1 中的表達(dá)分別為最低和最高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），選擇這兩種細(xì)胞株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用材料。

3.2轉(zhuǎn)染miR-19a mimics 和miR-19a inhibitor 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體外侵襲的影響 將miR-19a mimics轉(zhuǎn)染至鼻咽癌SUNE-1 細(xì)胞，同時(shí)將miR-19a inhibitor 轉(zhuǎn)染至鼻咽癌HNE1 細(xì)胞，RT-qPCR 結(jié)果表明，miR-19a mimics 組SUNE-1 細(xì)胞中的miR-19a表達(dá)水平明顯高于mimics NC 組（P＜0.01），而miR-19a inhibitor 組HNE1 細(xì)胞中的miR-19a 表達(dá)水平較inhibitor NC 組明顯減少（P＜0.01），見表1。

表1 各組miR-19a 表達(dá)水平比較（差異倍數(shù)，）

表1 各組miR-19a 表達(dá)水平比較（差異倍數(shù)，）

注：mimics NC 組為每孔SUNE-1 細(xì)胞加入100nmol 的mimics NC 及5μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-19a mimics 組為每孔SUNE-1 細(xì)胞加入100nmol的miR-19a mimics 及5μL 轉(zhuǎn)染試劑；inhibitor NC 組為每孔HNE1細(xì)胞加入100nmol 的inhibitor NC 及5μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-19a inhibitor組為每孔HNE1 細(xì)胞加入100nmol 的miR-19a inhibitor 及5μL 轉(zhuǎn)染試劑；與mimics NC 組相比，aP＜0.01；與inhibitor NC 組相比，bP＜0.01

腫瘤細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-19a mimics 后可明顯減少侵襲出Matrigel 基質(zhì)膠的SUNE-1 細(xì)胞數(shù)量（見圖1），mimic NC 組和miR-19a mimics 組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（25.6±4.4）和（10.5±2.1），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor 后可顯著促進(jìn)HNE1 細(xì)胞侵襲行為，inhibitor NC 組和miR-19a inhibitor 組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（16.9±2.5）和（34.2±4.9），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定體外鼻咽癌細(xì)胞侵襲

3.3驗(yàn)證miR-19a 的直接靶基因KRAS 為進(jìn)一步研究miR-19a 在鼻咽癌細(xì)胞EMT 中的可能作用機(jī)制，通過(guò)檢索miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得has-miR-19a 序列，并通過(guò)生物信息學(xué)工具TargetScan 對(duì)miR-19a可能存在的靶基因進(jìn)行分析。如圖2A 所示，發(fā)現(xiàn)KRAS 與has-miR-19a 存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，為此，我們進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證體外SUNE-1 細(xì)胞miR-19a 對(duì)KRAS 的調(diào)控作用。

圖2 生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)KRAS 與has-miR-19a 潛在的結(jié)合位點(diǎn)（A），Western blot 檢測(cè)KRAS 蛋白的表達(dá)（B）

熒光素酶報(bào)告檢測(cè)結(jié)果如表2 所示，與共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和inhibitor NC 后細(xì)胞熒光素酶活性相比較，在SUNE-1 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和miR-19a inhibitor后的熒光素酶活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而共轉(zhuǎn)染mut-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和miR-19a inhibitor 后細(xì)胞熒光素酶活性值與共轉(zhuǎn)染mut-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和inhibitor NC 后的細(xì)胞熒光素酶活性相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。用miR-19a mimics 和miR-19a inhibitor 分別轉(zhuǎn)染SUNE-1 和HNE1 細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot 分析鼻咽癌SUNE-1 和HNE1 細(xì)胞中KRAS 蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明（見圖2B），miR-19a mimics 組KRAS表達(dá)較mimics NC 組明顯減少（P＜0.01），而miR-19a inhibitor 組中的KRAS 表達(dá)水平顯著高于inhibitor NC 組（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，miR-19a 可與KRAS 的3'-UTR 結(jié)合，KRAS 是miR-19a 的直接靶向基因。

表2 各組熒光素酶活性比較（差異倍數(shù)，）

表2 各組熒光素酶活性比較（差異倍數(shù)，）

注：與wt-psiCHECK-KRAS-3'-UTR+inhibitor NC 組比較，aP＜0.01

3.4過(guò)表達(dá)KRAS 可挽救miR-19a 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT 過(guò)程的抑制作用 為證實(shí)miR-19a 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT 過(guò)程的抑制作用是否通過(guò)直接作用于其靶基因KRAS 而實(shí)現(xiàn)，將SUNE-1 細(xì)胞分為mimics NC 組、miR-19a mimics 組 和miR-19a mimics+KRAS mimics 組，細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A 所示，mimics NC 組、miR-19a mimics 組 和miR-19a mimics+KRAS mimics 組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（28.3±3.4）、（11.6±1.5）和（23.7±2.8），mimics NC 組和miR-19a mimics 組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。miR-19a mimics 組和miR-19a mimics+KRAS mimics 組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

Western blot 結(jié)果如圖3B 所示，與mimics NC組比較，miR-19a mimics 組鼻咽癌細(xì)胞N-cadherin、p-FAK 和p-SRC 均表達(dá)下調(diào)，而E-cadherin 表達(dá)上調(diào)。另外，SUNE-1 細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染KRAS mimics 后，miR-19a mimics 對(duì)E-cadherin、N-cadherin、p-FAK和p-SRC 蛋白表達(dá)的調(diào)控作用明顯被削弱。表明miR-19a 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT 過(guò)程的抑制作用可能通過(guò)直接作用于其靶基因KRAS 來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖3 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲（A），Western blot 測(cè)定E-cadherin、N-cadherin、KRAS、p-FAK 和p-SRC 的表達(dá)（B）

4 討論

EMT 作為一種自然發(fā)生的上皮細(xì)胞表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞特征的過(guò)程，是胚胎分化成熟的基礎(chǔ)。癌細(xì)胞在自身分子改變或腫瘤微環(huán)境的刺激下發(fā)生EMT，得以侵入基底膜并從原發(fā)腫瘤脫落，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。miRNAs 與EMT 過(guò)程聯(lián)系緊密，miR-125b 通過(guò)靶向調(diào)控生長(zhǎng)因子2 和生長(zhǎng)因子4 的表達(dá)，同時(shí)負(fù)性調(diào)控EMT 過(guò)程，從而削弱肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性和耐藥性[7]；上調(diào)miR-125b 的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞EMT，抑制腫瘤干細(xì)胞的生成[8-9]；SOX17/miR-371-5p/SOX2 軸可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT、干細(xì)胞特性和轉(zhuǎn)移傾向[10]。但miR-19a 與鼻咽癌轉(zhuǎn)移是否相關(guān)尚未見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 通過(guò)直接靶向調(diào)控KRAS 的表達(dá)，從而有效抑制體外鼻咽癌細(xì)胞EMT 行為。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，并且可作為重要的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[11-12]。因此，我們假設(shè)miR-19a 能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的EMT 和轉(zhuǎn)移。RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，正常鼻咽上皮細(xì)胞系中miR-19a 的表達(dá)遠(yuǎn)高于多種鼻咽癌細(xì)胞系；此外，miR-19a 在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SUNE-1 中表達(dá)相對(duì)較低，在低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HNE1 中表達(dá)相對(duì)較高。以上結(jié)果表明，miR-19a 可能作為一種EMT 抑制劑。同時(shí)，沉默miR-19a 的表達(dá)增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲性，而上調(diào)miR-19a 的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)EMT 的發(fā)生。

KRAS 是EMT 相關(guān)事件的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，下調(diào)KRAS 的表達(dá)能促進(jìn)包括卵巢癌和鼻咽癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤EMT 的發(fā)生[13-15]。然而，迄今為止，miR-19a與KRAS 之間的相互作用尚未研究，在我們的研究中，miR-19a 表達(dá)上調(diào)可以下調(diào)KRAS 在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)；此外，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步表明miR-19a 直接靶向KRAS 的3'-UTR 從而調(diào)控KRAS 的表達(dá)；最后我們通過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)KRAS 可逆轉(zhuǎn)miR-19a 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT 過(guò)程的抑制作用。上述結(jié)果說(shuō)明，miR-19a 通過(guò)抑制其靶基因KRAS 翻譯水平的表達(dá)，在抑制鼻咽癌細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

FAK 是一種胞質(zhì)非酪氨酸激酶受體，具有蛋白間交聯(lián)受體的功能[16]。研究表明，F(xiàn)AK 在多種侵襲性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[17]；鼻咽癌組織中FAK 活性與鼻咽癌細(xì)胞浸潤(rùn)表型有關(guān)，F(xiàn)AK 表達(dá)上調(diào)與轉(zhuǎn)移性鼻咽癌中侵襲性表型關(guān)系密切[18]。FAK 的下游信號(hào)因子如SRC 和PI3K 等可誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，由于FAK/SRC 通路激酶對(duì)細(xì)胞極性、黏附性、運(yùn)動(dòng)性和EMT 的潛在影響，被認(rèn)為是實(shí)體腫瘤有效的治療靶點(diǎn)[19-20]。本研究顯示，上調(diào)miR-19a 可抑制SUNE-1細(xì)胞中磷酸化FAK/SRC 水平和EMT 過(guò)程，從而表明FAK/SRC 通路的磷酸化水平可能在miR-19a 發(fā)揮抗癌作用中起到一定作用。

綜上所述，本研究結(jié)合之前的研究報(bào)道表明，miR-19a 可能通過(guò)靶向KRAS 以及負(fù)性調(diào)控FAK/SRC 通路從而抑制鼻咽癌細(xì)胞EMT 過(guò)程，這種過(guò)表達(dá)miR-19a 的方式可為未來(lái)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌治療提供一種特殊策略。