王菊粉， 曾嘉梅， 徐康麗， 李金瑞， 黃 晨， 柯勤飛

(東華大學 紡織學院， 上海 201620)

交通和建筑事故、自然災害等都會造成人體周圍神經損傷(peripheral nerve injury, PNI)[1-2]，導致患者的運動功能完全喪失，降低其生活質量，同時增加社會經濟負擔[3]。因此，PNI的修復與再生成為神經科學領域的研究熱點，常用的治療方法主要包括縫合手術、自體或異體移植以及人工神經導管橋接[4]。

對于小間隙(<5 mm)[5]PNI，縫合手術是一種較好的治療方法，但是這種方法存在神經束錯對和神經斷端卷曲，會造成組織增生的缺陷[6-7]。而對于大間隙(>5 mm)PNI，則需要移植物來橋接斷開的神經殘端。自體神經移植依然是目前臨床治療大間隙PNI的“金標準”[8-11]，該過程通常包括從患者腓腸神經獲取供體移植物，然后進行移植以橋接損傷部位。自體移植的局限性包括永久性供體部位并發(fā)癥、供體“犧牲”神經功能喪失、需要多次侵入性手術、感染風險增加[12]等。此外，在嚴重病例中，可用于自體移植的組織有限。而異體神經移植很容易產生異體間的排斥反應[13]，需要使用系統(tǒng)免疫抑制劑，直到施萬細胞和軸突萌芽再生，但是患者在這期間有發(fā)生感染或形成腫瘤的風險。

由于縫合手術、自體移植和異體移植存在許多局限性，組織工程技術成為了克服自體移植局限性的潛在解決方案[14-15]。典型的組織工程方法專注于通過植入天然、合成或半合成的基于生物材料的NGC(nerve guidance conduit)[16-18]來治療損傷。最初生物材料被設計成簡單的圓柱形管狀中空結構[19]，但是這種NGC的管壁比表面積小，不利于施萬細胞的黏附和增殖。此外，在大間隙PNI的修復中，中空型NGC的力學性能不足，降解期間往往會出現塊狀崩塌現象，對再生神經產生壓迫。Zhao等[20]引入多個管腔內通道來構建多通道神經導管，其設計是模仿神經束的結構。文獻[21-22]研究表明：導管內縱向排列的通道可以作為合成基底層所需的大比表面積微管發(fā)揮作用，對神經細胞的延伸、附著、增殖和施萬細胞的遷移有顯著的積極效應；在導管內，縱向多通道可以減少軸突分支的分散，有利促進軸突的延長。此外，縱向多通道可以減少再生軸突的錯向率。因此，多通道NGC被認為是比單通道NGC更合適的候選方案。

在現有研究基礎上設計一種制備多通道神經導管的犧牲模板，并結合冷凍干燥技術，制備了具有約20個通道的聚己內酯(polycaprolactone， PCL)多通道神經導管用以修復間隙大于2 cm的PNI，并通過加入水溶性致孔劑聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP)提高PCL多通道神經導管的比表面積和孔體積，得到PCL/PVP多通道神經導管。

1 試驗部分

1.1 試驗材料

PCL，Mn=80 000，美國Sigma-Aldrich公司；PVP，美國Sigma-Aldrich公司；丙酮，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；水溶性維綸紗線，直徑約為0.15 mm，俊輝紡織；鐵架，邊長10 cm，封騰工藝品；塑料空心管，直徑3 mm，四季鮮奶吧用品；小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)，美國Sigma-Aldrich公司；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基、雙抗(青霉素+鏈霉素)，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco公司；活/死細胞活力檢測試劑盒，賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的制備

將1.8 g PCL加入到8.2 g丙酮中，并在50 ℃水浴鍋中攪拌12 h，使得PCL完全溶解于丙酮中，形成混合均勻的PCL溶液。

向PCL溶液中加入0.5 g的 PVP，繼續(xù)在50 ℃水浴鍋中攪拌，直至溶液混合均勻形成PCL/PVP溶液。

1.2.2 犧牲模板的制備

犧牲模板的制備流程共分為6個步驟，如圖1所示。由圖1可知：先準備一個邊長10 cm的立方體鐵架，選鐵架平行的4條邊套6根彼此相互平行的橡皮筋；再沿上述鐵架4條平行邊的垂直方向的4條邊套6根彼此相互平行的橡皮筋；然后將維綸紗線穿過兩個方向上橡皮筋交叉形成的兩兩相對的孔，使得鐵架上下兩面之間具有20根互不相交的維綸紗線；然后將兩個方向上的橡皮筋分別收緊聚攏，使鐵架上下兩面之間形成具有20根相互平行的維綸紗線束；最后將直徑3 mm的塑料空心管沿側面切開后包裹在水溶性維綸紗線束的外側，并用透明膠帶在空心管切口處進行封口處理，避免向塑料空心管中注入溶液時發(fā)生溶液側溢。本文所用維綸紗線直徑約為0.15 mm，其常溫即溶、無毒且能被生物降解。由步驟5圖片特寫部分可以看出，維綸紗線繞在外層的橡皮筋上，而內層橡皮筋的作用是將每根維綸紗線分離開。試驗中溶液從步驟6圖片特寫部分用紅色線標注的位置注入。

圖1 犧牲模板的制備步驟

1.2.3 多通道神經導管的制備

用5 mL的醫(yī)用注射器將PCL溶液和PCL/PVP溶液注入犧牲模板的空心管中制備樣品，然后將犧牲模板放入冰箱中冷凍24 h，再將其置入冷凍干燥機中進行冷凍干燥處理。冷凍干燥處理8 h后，將帶有樣品的空心管從犧牲模板上剪下，并將樣品從空心管中抽出放入去離子水中浸泡12 h，使其內部的水溶性維綸紗線完全溶解，形成多通道導管，同時也使含有PVP樣品中的PVP得到充分溶解，在通道間形成可供物質交換的孔結構。最后將經水處理形成的樣品放入40 ℃烘箱中烘干，得到通道數等于或略少于20的多通道神經導管，原因是在向犧牲模板的空心管中注入溶液時，相鄰的維綸紗線可能會合并在一起，導致兩根或多根紗線形成一個通道，致使得到的多通道神經導管的通道數少于試驗預設的通道數。

1.3 測試與表征

1.3.1 多通道神經導管的形貌表征

將制備的PCL、PCL/PVP兩種多通道神經導管放入液氮中冷凍充分后取出，用美工刀快速切取多通道神經導管的橫截面和縱截面樣品，然后將樣品黏附在表面貼有導電膠的電鏡臺上。制樣完成后，對樣品進行一定時間的低溫噴銀處理，再把電鏡臺放入觀察室抽真空，然后進行測試。采用試驗儀器為TM 3000型掃描電子顯微鏡。

1.3.2 比表面積及孔結構表征

PCL、PCL/PVP兩種多通道神經導管在30 ℃真空脫氣24 h，以保證數據的準確性。然后采用ASAP 2460 型多站擴展式全自動快速比表面積與孔隙度分析儀測試PCL和PCL/PVP兩種多通道神經導管樣品的比表面積和孔徑分布，基于低溫氮物理吸附靜態(tài)容量法原理得到多通道神經導管的氮氣(N2)吸附-脫附等溫曲線及孔徑分布情況。

1.3.3 熱失重分析(TGA)

采用國產TGA 8000型熱失重分析儀對PCL顆粒、PVP顆粒以及PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的熱分解曲線進行測繪，設定升溫范圍為50～600 ℃，升溫速率為50 ℃/min。

1.3.4 傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征

采用美國的NicoletIn10 MX/Nicolet6700 型傅里葉紅外光譜儀對PCL顆粒、PVP顆粒以及PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管進行紅外分析。

1.3.5 X射線衍射(XRD)表征

采用日本的D/max-2550VB+/PC型18 kW轉靶X射線衍射儀對PCL顆粒、PVP顆粒以及PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管進行XRD分析。

1.3.6 拉伸斷裂性能測試

由于神經導管必須承受縫合過程中的機械張力，同時還要承受神經再生過程中生理活動所施加的負荷,本試驗采用YG026 MB 型多功能電子織物強力機測定多通道神經導管的拉伸斷裂性能。

1.3.7 細胞相容性測試

將制備的PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管分別切割成24孔板大小、厚度約1 mm的薄片，每種多通道神經導管各制備24個薄片分別平鋪于24孔板內，將樣品用紫外燈照射12 h，然后向每孔添加500 μL含有體積分數分別為10%的胎牛血清和1%的雙抗DMEM高糖培養(yǎng)液，浸潤12 h，再分別向每個孔內種植105個NIH 3T3細胞，之后置于37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱內培育。在培育的第2和5 d，用活/死細胞染色試劑盒對細胞進行染色，于熒光顯微鏡下觀察細胞的存活狀態(tài)，并用掃描電子顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)。

2 結果與討論

2.1 形態(tài)與結構

制備的PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的外觀圖像如圖2所示。

圖2 多通道神經導管的外觀圖像

由圖2可知，這兩種多通道神經導管的直徑均為(2.7±0.3) mm，長度均大于2 cm。

制備的PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的橫截面SEM圖如圖3所示。

由圖3可知，設計的約20個通道的神經導管，由于水溶性維綸紗線之間合并，導致通道數可能少于20。

圖3 多通道神經導管的橫截面SEM圖

PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的縱截面SEM圖如圖4所示。由圖4可知，制備的多通道神經導管通道內形成了直徑為(2.7±0.3) mm的內通道結構。對比這兩種多通道神經導管的截面SEM圖，可以明顯觀察到PCL多通道神經導管的結構比較致密，而PCL/PVP多通道神經導管具有更高的孔隙率，而且內通道間存在孔結構，這種孔結構有利于通道間進行物質交換，更符合仿生結構。

圖4 多通道神經導管的縱截面SEM圖

2.2 比表面積和孔結構分析

對制備的PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管進行N2吸附-脫附分析，得到PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的比表面積分別約為0.67、1.35 m2/g，后者比表面積約為前者的2倍。這表明在制備多通道神經導管的溶液中加入PVP，可以有效地增加多通道神經導管的比表面積，更有利于施萬細胞的黏附和生長。

PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的N2吸附-脫附等溫曲線圖和孔徑分布圖如圖5所示。由圖5可知，這兩種多通道神經導管的N2吸附-脫附等溫曲線形狀相同，根據國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)提供的物理吸附等溫線分類，這種曲線屬于IV型[23]，由于吸附、脫附等溫曲線不重合，可以觀察到有明顯的H3型等溫回滯環(huán)。在相對低壓區(qū)域，N2的吸收量緩慢上升，表明制備的多通道神經導管中存在微孔(孔徑<2.0 nm)結構；在相對高壓的區(qū)域，N2的吸收量有一個陡峭的上升，表明制備的多通道神經導管中存在介孔(孔徑為2.0～50.0 nm)結構[24]。在相對壓力為1時，PCL/PVP多通道神經導管明顯比PCL 多通道神經導管有更高的N2吸附量，說明在制備溶液中加入PVP可以增加神經導管的孔體積，使多通道神經導管的孔隙率更大。試驗測得PCL多通道神經導管的主要孔徑為2.0～60.0 nm，PCL/PVP多通道神經導管的主要孔徑為1.4～40.0 nm，這兩種多通道神經導管的孔結構均以介孔為主。對比兩種多通道神經導管的孔徑分布曲線可以發(fā)現，PCL/PVP多通道神經導管的孔徑分布曲線擁有更大的面積，說明在制備多通道神經導管的溶液中加入適量PVP可以使其具有更多的介孔體積，而孔徑小于30.0 nm的介孔[24]有利于多通道神經導管的通道間進行物質交換。

圖5 多通道神經導管的N2吸附-脫附等溫曲線圖和孔徑分布圖

2.3 TGA分析

制備的PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的TGA曲線如圖6所示。

圖6 PCL顆粒、PVP顆粒、PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的TGA曲線

由圖6可知，PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的TGA曲線與PCL顆粒的TGA曲線形態(tài)相似，在350 ℃后質量開始急劇下降，說明PCL在此溫度開始大量分解，到450 ℃時質量逐漸趨于0，PCL完全分解，表明制備的多通道神經導管具有良好的熱穩(wěn)定性。而PVP顆粒的TGA曲線在50～100 ℃ 有一段質量損失，是PVP顆粒具有吸水性所導致的。在400～480 ℃，PVP質量急劇下降，說明PVP在此溫度范圍內分解。PCL/PVP多通道神經導管在200～350 ℃有一段質量損失，可能是多通道神經導管中未烘干水份的蒸發(fā)以及PCL/PVP多通道神經導管的孔體積中含有的空氣被釋放所導致，說明制備多通道神經導管的過程中引入PVP并不會對神經導管的熱穩(wěn)定性造成明顯影響。

2.4 FTIR分析

PCL顆粒、PVP顆粒以及PCL和PCL/PVP兩種多通道神經導管的紅外光譜圖如圖7所示。

圖7 PCL顆粒、PVP顆粒、PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管的紅外光譜圖

2.5 XRD分析

PCL顆粒、PVP顆粒、PCL和PCL/PVP兩種多通道神經導管的XRD曲線如圖8所示。由圖8可知，制備的PCL多通道神經導管的衍射峰與PCL顆粒的衍射峰一致，2θ在 21.57°和23.85°處分別出現了一個很強的衍射吸收峰和一個較弱的衍射吸收峰，與文獻[27]中PCL的特征衍射吸收峰一致，因此可以說明在多通道神經導管的制備過程中沒有破壞PCL的晶型。而制備的PCL/PVP多通道神經導管在2θ=10.54°處有一個較弱的衍射峰，屬于PVP的特征峰，說明制備的PCL/PVP多通道神經導管中可能含有少量未被水解完全的致孔劑PVP。PVP屬于可生物降解材料，具有生物相容性，因此制備的PCL/PVP多通道神經導管中含有少量PVP并不會影響其在組織工程上的使用。

2.6 拉伸斷裂性能

對制備的導管直徑為2.5 mm、長度為2 cm的PCL和PCL/PVP兩種多通道神經導管進行軸向拉伸斷裂性能測試，得到應力-應變曲線如圖9所示。由圖9可知，PCL多通道神經導管在應變?yōu)?0%時應力達到最大值2.5 MPa，而PCL/PVP多通道神經導管在應變?yōu)?2.5%時應力達到最大值1.75 MPa，這是由于PVP使得多通道神經導管擁有更多孔體積，從而降低了多通道神經導管的力學性能。本文制備的多通道神經導管的力學性能與文獻[28]中報道的PCL 神經導管的力學性能基本一致，表明這種多通道神經導管可用于修復間隙大于2 cm的PNI。

2.7 細胞相容性

NIH 3T3細胞分別在PCL和PCL/PVP兩種多通道神經導管的樣品上生長2和5 d后，活細胞(綠色)和死細胞(紅色)的熒光現象如圖10所示。由圖10可知，兩種多通道神經導管材料均支持NIH3T3細胞的生長，在培養(yǎng)的第2 d，細胞數量較少，培養(yǎng)的第5 d，細胞數量明顯增加。在細胞培養(yǎng)的2和5 d，PCL/PVP多通道神經導管比PCL多通道神經導管表面有更多的活細胞，而死細胞的數量差距不大，說明PCL/PVP多通道神經導管更有助于細胞生長，這表明水溶性致孔劑PVP增加了多通道神經導管的孔隙率和比表面積，更有利于細胞的黏附和增殖。

圖10 活死細胞熒光染色圖片

NIH 3T3細胞在PCL/PVP多通道神經導管樣品材料上的生長情況如圖11所示，其中綠色部分為細胞。由圖11可知，NIH 3T3細胞在PCL/PVP多通道神經導管樣品上生長2 d時，細胞數量較少，當細胞生長5 d時，細胞鋪展在PCL/PVP多通道神經導管表面形成細胞聚集區(qū)。由此說明，制備的PCL/PVP多通道神經導管可以使細胞增殖和生長，具有細胞相容性。

圖11 NIH 3T3細胞生長2和5 d的SEM圖

3 結 語

本研究結合冷凍干燥技術和犧牲模板法制備出長度大于2 cm，且具有約20個通道的PCL多通道神經導管和PCL/PVP多通道神經導管。將這兩種多通道神經導管制備的薄片通過活/死細胞染色試劑盒對細胞染色后，利用熒光顯微鏡觀察細胞存活狀態(tài)，用掃描電子顯微鏡觀察其生長狀態(tài)。試驗結果表明，在制備PCL/PVP多通道神經導管時引入的PVP可以使神經導管具有更好的細胞相容性。相較于其他多通道神經導管的制備方法，冷凍干燥技術和犧牲模板法結合的制備方法工藝簡單且成本低廉。但由于目前條件的限制，無法進一步進行動物體內試驗，在未來的研究中，將進行更加全面系統(tǒng)的生物相容性評價和動物試驗。