關(guān)樺楠，張 悅，龔德壯，宋 巖

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150028）

0 引言

鄰苯二酚（Catechol，CC），是一種廣泛應(yīng)用于染料、化妝品和農(nóng)藥等行業(yè)的毒性較強(qiáng)物質(zhì)，對(duì)環(huán)境和人類的健康構(gòu)成了很大的威脅［1-2］。因此，檢測(cè)CC的殘留對(duì)于人類健康和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。目前，CC的常規(guī)檢測(cè)方法一般具有操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高和耗時(shí)長等缺陷。其中，電化學(xué)酶生物傳感器檢測(cè)CC具有靈敏、快速和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但是需要依賴于天然過氧化物酶的活性，使其難以推廣使用。與天然酶相比，納米材料模擬酶具有成本低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于貯存、易于回收和活性可調(diào)等顯著的優(yōu)勢(shì)。其中Fe3O4是一種廣泛應(yīng)用于電化學(xué)、催化和傳感器等領(lǐng)域的金屬氧化物催化劑［3］。由于Fe3O4納米顆粒的磁性核心具有較大的表面自由能和強(qiáng)磁偶極矩的相互作用，可以重復(fù)的回收利用，減少利用成本［4］，然而彼此之間也容易發(fā)生聚集現(xiàn)象［5］，降低催化活性，因此，需要通過在磁性核心表面包覆金納米粒子（AuNPs）的方法，制備磁性納米復(fù)合顆粒來克服磁性納米顆粒自身的不足［6-7］。此外，AuNPs還具有高比表面積、優(yōu)異的表面改性能力和高穩(wěn)定性等獨(dú)特的模擬酶性質(zhì)［8］，已成功地在許多電化學(xué)反應(yīng)中被用作有效的電催化劑［9］，通過調(diào)諧信號(hào)放大和加速電子轉(zhuǎn)移，大大增強(qiáng)了傳感器的靈敏度和選擇性。

本文采用自組裝的方法將AuNPs包覆于Fe3O4磁性納米顆粒的外表面，制備出具有過氧化物模擬酶活性的復(fù)合納米材料（Fe3O4@Au）。并考察Fe3O4@Au的過氧化物模擬酶活性，根據(jù)模擬酶催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基，促進(jìn)CC發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成鄰苯醌，增加電極表面電子轉(zhuǎn)移的原理，建立電化學(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定CC含量的簡便方法。將為高效檢測(cè)CC的殘留提供參考依據(jù)。

1 儀器及試劑

1.1 儀器

H-7500型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；YZHR-25型水熱反應(yīng)釜（上海耀冠儀器有限公司）；PS-100A型超聲波清洗機(jī)（深圳市得康洗凈電器有限公司）；VSM LDJ 9600型振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)（北京翠海佳誠磁電科技有限責(zé)任公司）；FC204型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；JY-PH160型pH計(jì)（廣州佳儀精密儀器有限公司）；CS310H型電化學(xué)三電極工作站（武漢科思特儀器股份有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州鴻澤實(shí)驗(yàn)科技有限公司）。

1.2 試劑

NaAc·3H2O、冰 醋 酸、H2O2、PEG-4000、乙醇、氯金酸（分析純，上海諾泰化工有限公司）；FeCl3·6H2O（分析純，海博生物技術(shù)有限公司）；乙二醇（分析純，天津市華東試劑廠），3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）（分析純，淮安和元化工有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 金磁微粒的制備和表征

取2 g Fe3O4納米微粒超聲分散于50 mL含有20 %乙醇的水溶液中，逐滴加入1 mL APTES，于室溫下攪拌12 h，反應(yīng)結(jié)束后可看到具有細(xì)微顆粒的懸濁液呈淺棕色，得到產(chǎn)物即為氨基化改性后的Fe3O4納米微粒。采用0.1 mol/L的HAc-乙醇溶液磁分離清洗所得產(chǎn)物3次，烘干后備用。取上述已氨基化改性的Fe3O4納米微粒2 g于燒杯中，在室溫下150 r/min的磁力攪拌器中不斷攪拌，并迅速加入20 mL所制備的金納米粒子溶液，混合溶液由棕色逐漸變淡，低速攪拌反應(yīng)8 h后，獲得Fe3O4@Au金磁微粒。置于超聲波清洗器上超聲振蕩使其均勻分散，然后利用透射電子顯微鏡觀察材料的形貌和粒徑。

2.2 金磁微粒模擬酶活性驗(yàn)證

采用循環(huán)伏安（CV）法評(píng)估Fe3O4@Au對(duì)CC的電化學(xué)響應(yīng)行為。所有電化學(xué)試驗(yàn)均采用電化學(xué)工作站三電極系統(tǒng)完成，其中，玻碳電極（GCE）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為輔助電極。

篩選4種不同的反應(yīng)體系，采用CV法驗(yàn)證Fe3O4@Au檢測(cè)CC過程中的過氧化物模擬酶的活性：

（1）H2O2+CC體系：向盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH=5）的小燒杯中加入200 μL的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 mmol/L），將反應(yīng)體系混勻置于溫度為20 ℃水浴鍋中（反應(yīng)過程中每隔1 min溫和搖晃一次，下同），最后加入200 μL CC標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 mmol/L）。

（2）H2O2+Fe3O4@Au體系：將0.012 5 g Fe3O4@Au納米粉末加入到盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH=5）的小燒杯中，將反應(yīng)體系混勻置于溫度為20 ℃水浴鍋中，加入 200 μL H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（3）CC+Fe3O4@Au體系：將0.012 5 g Fe3O4@Au納米粉末加入到盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH=5）的小燒杯中，將反應(yīng)體系混勻置于溫度為20 ℃水浴鍋中，加入200 μL CC標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（4）H2O2+CC+Fe3O4@Au體系：將0.012 5 g Fe3O4@Au納米粉末加入到盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH=5）的小燒杯中，再加入200 μL H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后，將反應(yīng)體系混勻置于溫度為20 ℃水浴鍋中充分反應(yīng)15 min后，加入200 μL CC標(biāo)準(zhǔn)溶液。

調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站掃描速率為0.10 V/s，監(jiān)測(cè)（1）→（4）氧化峰電流并取其絕對(duì)值，重復(fù)試驗(yàn)3次，將其作為體系指標(biāo)，指標(biāo)越大越好。

2.3 單因素優(yōu)化檢測(cè)體系

將不同添加量的Fe3O4@Au粉末（0.005，0.007 5，0.01，0.012 5，0.015 g）分別加入到不同pH值（4，5，6，7，8，9）的 10 mL HAc-NaAc 緩沖溶液中混勻，再加入200 μL的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其置于不同的水浴溫度（4，20，30，40，50 ℃），充分反應(yīng)15 min后（在此期間需要溫和搖晃，使其反應(yīng)均勻），再加入200 μL CC標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站采用不同掃描速率（0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 V/s）進(jìn)行檢測(cè)。監(jiān)測(cè)氧化峰電流的絕對(duì)值，重復(fù)試驗(yàn)3次，并將其作為體系指標(biāo)，指標(biāo)越大越好。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化檢測(cè)體系

分別考察反應(yīng)溫度（A因素）、Fe3O4@Au添加量（B因素）、掃描速率（C因素）和pH值（D因素）對(duì)整個(gè)試驗(yàn)體系的影響，每種因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平（根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化得出），選用L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

采用電化學(xué)工作站三電極系統(tǒng)，利用CV法檢測(cè)體系中的CC濃度，監(jiān)測(cè)氧化峰電流絕對(duì)值的變化，重復(fù)試驗(yàn)3次，并確定因素影響的主次順序及優(yōu)選方案。

2.5 金磁微粒模擬酶工作曲線的構(gòu)建

按照優(yōu)化試驗(yàn)得出的最適電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系對(duì)不同濃度（0.001，0.002 5，0.005，0.01，0.025，0.05，0.1 mmol/L）的CC進(jìn)行檢測(cè)，以CC的濃度為橫坐標(biāo)，以氧化峰電流絕對(duì)值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，并計(jì)算最低檢測(cè)限和回收率。

2.6 金磁微粒模擬酶抗干擾性研究

為驗(yàn)證電化學(xué)體系在檢測(cè)過程中的抗干擾性能，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下向電化學(xué)檢測(cè)體系中分別加入濃度為 10 mmol/L 的 MgSO4、KCl、AlCl3、Zn（NO3）2、CaCl2和葡萄糖等常見干擾物質(zhì)，觀察氧化峰電流絕對(duì)值的變化，對(duì)其抗干擾性能進(jìn)行評(píng)估。

3 結(jié)果與討論

3.1 金磁微粒的表征

取Fe3O4納米粒子的水溶液稀釋至一定濃度，采用高分辨率透射電鏡觀察粒子的形貌和粒徑分布，如圖1所示。制備的粒子多為球形，平均粒徑約為130 nm。由于磁性納米粒子具有較高的比表面能和粒子與粒子之間的偶極矩作用，使得Fe3O4磁性納米粒子出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象。

采用透射電子掃描顯微鏡觀察所制備出的AuNPs外觀形貌和粒徑大小，結(jié)果如圖2所示。AuNPs形狀均一，基本呈現(xiàn)圓球形，且分散度良好，基本沒有聚集。

圖2 AuNPs的透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig.2 Transmission electron microscope picture of AuNPs

采用APTES將Fe3O4納米粒子表面氨基化，用于吸附AuNPs。APTES是一種常用氨基偶聯(lián)劑，水解產(chǎn)生的羥基可與磁性納米粒子表面基團(tuán)發(fā)生脫水反應(yīng)，將硅烷接枝到磁性納米粒子的表面［10］。因?yàn)锳PTES末端含有氨基，所以可以在磁性納米粒子表面形成一個(gè)氨基單分子層。AuNPs與Fe3O4納米粒子通過氨基相交聯(lián)，從而形成穩(wěn)定的Fe3O4@Au粒子，結(jié)果如圖3所示。Fe3O4納米粒子的表面吸附有密集的AuNPs，表明氨基化的磁性材料可以固載AuNPs。利用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測(cè)量組裝型Fe3O4@Au粒子的飽和磁化強(qiáng)度為43 emu/g。試驗(yàn)表明，復(fù)合微粒的磁化強(qiáng)度會(huì)隨著AuNPs的含量升高而產(chǎn)生輕微降低的現(xiàn)象，較低的飽和磁化強(qiáng)度表明制備的Fe3O4@Au粒子中Fe3O4納米粒子相對(duì)含量低而AuNPs相對(duì)含量高。綜上所述，F(xiàn)e3O4@Au的飽和磁化強(qiáng)度可以一定程度上阻止納米磁性團(tuán)簇的聚合，同時(shí)可以滿足納米磁性團(tuán)簇磁分離和回收的條件。

圖3 Fe3O4@Au粒子透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig.3 Transmission electron microscope picture of Fe3O4@Au particles

3.2 金磁微粒模擬酶活性的驗(yàn)證

由圖4可知，當(dāng)體系中只有H2O2和Fe3O4@Au粒子存在時(shí)，沒有氧化還原峰產(chǎn)生，即體系中沒有發(fā)生氧化還原反應(yīng)，說明H2O2的電化學(xué)活性較低，H2O2和Fe3O4@Au粒子不足以產(chǎn)生電流響應(yīng)；當(dāng)體系中有CC和H2O2存在時(shí)，氧化還原峰產(chǎn)生，即體系中發(fā)生氧化還原反應(yīng)，這可能是由于H2O2在溶液中產(chǎn)生了微量的具有氧化活性的自由基，而這些微量的自由基與CC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生電流峰；當(dāng)體系中加入CC與Fe3O4@Au時(shí)，氧化還原峰產(chǎn)生，說明Fe3O4@Au可一定程度上催化溶液中的氧產(chǎn)生自由基，并與CC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，也證明Fe3O4@Au具有過氧化物模擬酶的活性；當(dāng)體系中同時(shí)存在CC、H2O2和Fe3O4@Au時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值明顯增大，說明Fe3O4@Au作為過氧化物模擬酶極大地催化H2O2產(chǎn)生大量的具有氧化活性的自由基，促使CC氧化為鄰苯醌，并伴隨有大量的電子轉(zhuǎn)移，增加電流響應(yīng)，從而增大氧化電流峰。因此，應(yīng)采用同時(shí)存在CC、H2O2和Fe3O4@Au的體系進(jìn)行試驗(yàn)。綜上所述，證明Fe3O4@Au具有過氧化物模擬酶的催化活性，也證明其作為過氧化物模擬酶可起到增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)的作用。

圖4 模擬酶活性驗(yàn)證曲線Fig.4 Validation curve of simulated enzyme activity

3.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化檢測(cè)體系

3.3.1 金磁微粒添加量對(duì)電化學(xué)檢測(cè)體系的影響

由圖5（a）可知，體系總體積為10.40 mL，F(xiàn)e3O4@Au添加量在0.005～0.012 5 g范圍內(nèi)時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值隨添加量的增加逐漸增大。這是由于一方面，隨著Fe3O4@Au添加量的增加，體系內(nèi)的模擬酶活性也增強(qiáng)，從而促進(jìn)H2O2催化反應(yīng)產(chǎn)生更多具有氧化活性的自由基，進(jìn)而與CC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，增加電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生電流響應(yīng)；另一方面，有少量的Fe3O4@Au附著于電極的表面，增大電極的靈敏度。當(dāng)Fe3O4@Au添加量處于0.012 5～0.015 g范圍內(nèi)時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值明顯下降，這是由于隨著體系中Fe3O4@Au添加量不斷地增加，納米粒子發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，導(dǎo)致復(fù)合納米模擬酶催化活性逐漸降低［11］。綜上所述，F(xiàn)e3O4@Au添加量在0.012 5 g時(shí)電化學(xué)檢測(cè)效果最優(yōu)。因此，F(xiàn)e3O4@Au添加量選取0.01，0.012 5，0.015 g參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)最為適合。

3.3.2 溫度對(duì)電化學(xué)檢測(cè)體系的影響

由圖 5（b）可知，當(dāng)溫度處于 4～20 ℃范圍內(nèi)時(shí)，隨著溫度的增加，氧化峰電流絕對(duì)值不斷地增大。當(dāng)溫度處于20～30 ℃范圍內(nèi)時(shí)，隨著溫度的增加，F(xiàn)e3O4@Au模擬酶的催化活性增強(qiáng)，體系的反應(yīng)速率迅速增大，產(chǎn)生大量的氧化自由基，并與CC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，增大電子轉(zhuǎn)移速率和電化學(xué)響應(yīng)，因此氧化峰電流絕對(duì)值顯著升高。當(dāng)溫度處于30～50 ℃范圍內(nèi)時(shí)，反應(yīng)速率明顯下降，由于在較高的溫度下，F(xiàn)e3O4@Au模擬酶的催化活性受到了一定程度的抑制，使得體系中電子轉(zhuǎn)移速率減小。綜上所述，溫度選取30，40，50 ℃參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)最為適合。

3.3.3 pH值對(duì)電化學(xué)檢測(cè)體系的影響

由圖5（c）可知，當(dāng)pH=5時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)Fe3O4@Au模擬酶的催化效果最為顯著。當(dāng)pH=4時(shí)，氧化峰電流絕對(duì)值顯著下降，這是由于在較酸性溶液中含有大量的質(zhì)子，從而影響反應(yīng)體系中電子的轉(zhuǎn)移，降低電化學(xué)的響應(yīng)。當(dāng)pH處于5～9范圍內(nèi)時(shí)，隨著pH值不斷地增加，氧化峰電流絕對(duì)值明顯的降低，這可能是由于體系中的質(zhì)子隨著pH值不斷地增加而減少，而質(zhì)子參與體系的氧化還原反應(yīng)［12］，當(dāng)質(zhì)子處于短缺的狀態(tài)時(shí)，體系很難發(fā)生氧化還原反應(yīng)，電子轉(zhuǎn)移量減少，電化學(xué)響應(yīng)降低，從而氧化峰電流絕對(duì)值降低。綜上所述，選取pH值為4，5，6參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)最為適合。

3.3.4 掃描速率對(duì)電化學(xué)檢測(cè)體系的影響

由圖5（d）可知，隨著掃描速率的逐漸增加，體系的氧化峰電流絕對(duì)值顯著地上升。這是由于體系中的電子轉(zhuǎn)移過程受控于擴(kuò)散效應(yīng)［13］，掃描速率增加，電子轉(zhuǎn)移速率隨之增大，電化學(xué)響應(yīng)增加，從而氧化峰電流絕對(duì)值增高。因此，選取掃描速率為0.06，0.08，0.10 V/s參與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)最為適合。

圖5 單因素優(yōu)化CC電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系Fig.5 Single-factor optimization of CC enhanced electrochemical detection system

3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化檢測(cè)體系

由表1可知，通過極差分析可得到試驗(yàn)各因素對(duì)氧化峰電流絕對(duì)值的影響主次順序：C＞D＞A＞B。通過極差分析確定的最優(yōu)試驗(yàn)方案組合為A3B2C3D2，即在檢測(cè)體系體積為10.40 mL時(shí)，反應(yīng)溫度50 ℃，F(xiàn)e3O4@Au添加量0.012 5 g/mL，掃描速率0.10 V/s和緩沖液pH=5。正交優(yōu)化的結(jié)果與單因素優(yōu)化結(jié)果基本吻合，以最優(yōu)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，氧化峰電流絕對(duì)值平均值約為55.54 μA。綜上所述，說明掃描速率是影響Fe3O4@Au模擬酶催化體系的主要因素，溫度、pH值和Fe3O4@Au添加量對(duì)模擬酶檢測(cè)CC體系也有相應(yīng)的影響。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.1 The result of orthogonal experiment

3.5 模擬酶檢測(cè)體系的工作曲線、檢測(cè)限和回收率

由圖6可知，CC濃度在0.001～0.1 mmol/L范圍內(nèi)，與氧化峰電流絕對(duì)值具有良好的線性關(guān)系，工作曲線回歸方程為y=1189.2x+39.693，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 5，計(jì)算最低檢出限為 0.014 89 μmol/L。為評(píng)估體系的檢測(cè)實(shí)用性，選取濃度為0.005 mmol/L和0.025 mmol/L的CC標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)的檢測(cè)體系下，根據(jù)所得的工作曲線回歸方程，進(jìn)行回收率的評(píng)價(jià)，計(jì)算其回收率分別為97.10%和101.44%。結(jié)果表明，在Fe3O4@Au模擬酶催化的電信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)下，所建立的檢測(cè)方法對(duì)CC具有較高的靈敏度和精密度。

圖6 模擬酶電化學(xué)增強(qiáng)體系檢測(cè)CC的工作曲線Fig.6 Working curve of CC detection by mimetic enzyme electrochemical enhancement system

3.6 模擬酶檢測(cè)鄰苯二酚的抗干擾性研究

選取食品及環(huán)境中6種常見物質(zhì)作為干擾物質(zhì)，對(duì)體系的抗干擾性能進(jìn)行評(píng)估。以濃度為0.01 mmol/L的CC作為參照標(biāo)準(zhǔn)，選取濃度為10 mmol/L 的 MgSO4、KCl、AlCl3、Zn（NO3）2、CaCl2和葡萄糖作為干擾物質(zhì)。由圖7可知，電化學(xué)增強(qiáng)體系對(duì) MgSO4、KCl、AlCl3、Zn（NO3）2、CaCl2和葡萄糖沒有顯著的電流響應(yīng)，而對(duì)CC表現(xiàn)出顯著的電流響應(yīng)，具有較高的氧化峰電流絕對(duì)值。表明該電化學(xué)增強(qiáng)體系對(duì)CC的檢測(cè)具有良好的選擇性和抗干擾性能。

圖7 檢測(cè)體系的抗干擾性Fig.7 Anti interference of detection system

4 結(jié)語

本文將AuNPs包覆于Fe3O4磁性納米粒子的表面，以減少Fe3O4磁性納米粒子的聚集，制備飽和磁化強(qiáng)度為43 emu/g的具有過氧化物模擬酶活性的Fe3O4@Au復(fù)合納米粒子。通過活性驗(yàn)證試驗(yàn)證明該模擬酶具有良好的催化活性。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系的最佳方案，即在檢測(cè)體系體積為10.40 mL下，反應(yīng)溫度為50 ℃，金磁微粒添加量為0.012 5 g/mL，掃描速率為0.10 V/s，緩沖溶液pH=5。此外，經(jīng)試驗(yàn)證明該電化學(xué)增強(qiáng)檢測(cè)體系具有較低的檢測(cè)限、良好的抗干擾性和選擇性?？梢愿咝А?zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)CC的濃度，為食品質(zhì)量安全檢測(cè)工作提供一種高效便捷的途徑。