王紅梅,石青,王晨,郭貝,鄭莉
(湖北省普林標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司,武漢 430050)
中醫(yī)藥是我國(guó)醫(yī)藥衛(wèi)生的重要組成部分,具有悠久的歷史傳統(tǒng),是中華民族智慧的結(jié)晶,其獨(dú)特的治療理念已逐漸被其它國(guó)家所接受。目前我國(guó)常用的植物源中藥材有600 多種[1-2],每年有大量中藥材出口到包括美國(guó)、日本在內(nèi)的近100 個(gè)國(guó)家和地區(qū)[3-4]。由于人類對(duì)中藥材需求量較大,野生中藥材資源日漸匱乏,人工種植中藥材成為中藥材市場(chǎng)的主流。為了控制病蟲(chóng)害,提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量,農(nóng)藥的使用量逐漸增加。另外,種植基地的大氣、土壤及灌溉水質(zhì)量等均是導(dǎo)致中藥材中農(nóng)藥殘留的重要因素[5]。近年來(lái),中藥材中農(nóng)藥的檢出率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。何清彥等[6]考察了10 種30 批藥食兩用藥材中有機(jī)氯的殘留量,檢出率為100%;鄭雙雙等[7]以《歐洲藥典》為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)金銀花、澤瀉和川芎中11種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)金銀花、澤瀉和川芎的不合格率分別為60%、40%和10%;王瑩等[8]調(diào)查了枸杞中擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留情況,發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和氯氟氰菊酯4 種中等毒性的農(nóng)藥檢出率均超過(guò)25%,其中氰戊菊酯的檢出率高達(dá)75%,因此建立高效、精準(zhǔn)的中藥材中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。
測(cè)定農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[9]。氣相色譜法主要是根據(jù)待測(cè)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)及其所含元素的不同,選擇相應(yīng)的檢測(cè)器,不適合對(duì)多種不同類型農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)。液相色譜法適用于不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定化合物的分析,此法分離效率高、分析速度快,但是液相色譜檢測(cè)器不能準(zhǔn)確檢測(cè)化合物結(jié)構(gòu),主要依賴于色譜柱的分離度來(lái)定性,不適合多種農(nóng)藥殘留高通道同時(shí)檢測(cè)[10]。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法作為一種典型的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),可對(duì)難以區(qū)分的熱穩(wěn)定好且易揮發(fā)的同分異構(gòu)體進(jìn)行分離鑒定,可根據(jù)農(nóng)藥分子的特征離子碎片,準(zhǔn)確鑒別未知農(nóng)藥化合物,適合多組分農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)。
常用的中藥材樣品處理方法有固相萃取法、基于QuEChERS 原則的處理方法、凝膠滲透色譜法、加速溶劑萃取法等[11]。凝膠滲透色譜法和加速溶劑萃取法能準(zhǔn)確分離農(nóng)藥殘留組分,減少基質(zhì)干擾,但需要消耗大量溶劑和標(biāo)準(zhǔn)品,操作繁瑣且易造成二次污染;固相萃取法在一定程度上對(duì)樣品能起到凈化作用,但是對(duì)于多種農(nóng)藥同時(shí)分析時(shí)難以保證所有農(nóng)藥回收率均較佳;基于QuEChERS 原則的處理方法提取過(guò)程較繁瑣[12],而且鹽包中的硫酸鎂溶解時(shí)會(huì)放出大量的熱量,影響熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的測(cè)定結(jié)果,因此不同樣品處理方法各有優(yōu)勢(shì),但也同時(shí)存在缺點(diǎn)和局限性。
目前中藥材中農(nóng)藥殘留檢測(cè)主要面臨兩方面問(wèn)題。一方面是中藥材品種繁多,而且每種中藥材成分的理化性能差異較大,難以建立一種統(tǒng)一的樣品處理方法,甚至對(duì)于一些基質(zhì)特殊的中藥材還沒(méi)有摸索出適合的樣品處理方法;另一方面是農(nóng)藥品種多樣,物理化學(xué)性質(zhì)差異較大,在藥材中殘留量較低,一般為痕量級(jí),且中藥材中部分成分的理化性能與農(nóng)藥成分相似,導(dǎo)致農(nóng)藥殘留的提取和凈化難度增大[13-14]。筆者以氣相-串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測(cè)手段,對(duì)200 種中藥材中35 種農(nóng)藥檢測(cè)時(shí)的樣品處理方法進(jìn)行了梳理,比較分析了基于QuEChERS 原則的處理方法、石墨化碳黑氨基復(fù)合固相萃取(GCBNH2)法和親水親油平衡材料固相萃?。℉LB)法3種樣品處理方法的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)化了不同類型中藥材的樣品處理方案,為今后中藥材檢測(cè)提供參考。
氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀:7890B-7010B GC/TQ 型,美國(guó)安捷倫科技有限公司。
電子天平:XS105DU 型,感量為0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。
全自動(dòng)均質(zhì)器:AH-50 型,??萍瘓F(tuán)股份有限公司。
高通道真空平行濃縮儀:MPE 型,??萍瘓F(tuán)股份有限公司。
高通道全自動(dòng)固相萃取儀:FS 360 型,睿科集團(tuán)股份有限公司。
可調(diào)式混勻儀:MX-S 型,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)室儀器(北京)股份公司。
35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:編號(hào)為CDAA-M-490405-TZ-1ML,各農(nóng)藥質(zhì)量濃度見(jiàn)表1,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
表1 35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各農(nóng)藥質(zhì)量濃度
甲苯、乙腈:均為色譜級(jí),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
氯化鈉:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
基質(zhì)固相分散材料(MSPD)、親水親油平衡材料固相萃取小柱(HLB)和石墨化碳黑氨基復(fù)合固相萃取小柱(GCB-NH2):上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
金銀花樣品:客戶送檢。
1.2.1 基于QuEChERS 原則的處理方法
準(zhǔn)確稱取3.00 g 金銀花粉末(過(guò)三號(hào)篩)于50 mL 離心管中,加入1%乙酸溶液15 mL,渦旋,使藥粉充分浸潤(rùn),靜置30 min,加入15 mL 乙腈,渦旋,混勻,置于振蕩器中以500 次/分的頻率震蕩5 min,加入無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水硫酸鈉的混合粉末(質(zhì)量比為4∶1)7.5 g,立即搖散,置于振蕩器中以500次/分的頻率震蕩3 min,于冰浴中冷卻10 min,以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液9 mL,置于預(yù)先裝有凈化材料(無(wú)水硫酸鎂900 mg,N-丙基乙二胺300 mg,十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg,硅膠300 mg,石墨化炭黑90 mg)的分散固相萃取凈化管中渦旋,混勻,置于振蕩器中以500 次/分的頻率震蕩5 min,精密吸取上清液5 mL,置于氮吹儀上濃縮至0.4 mL,加入乙腈稀釋至2.0 mL,渦旋混勻,濾過(guò)得樣品處理液。將上述樣品處理液過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜,取1.0 mL,加入0.01 mL乙腈,混勻,待測(cè)。
1.2.2 HLB 法
準(zhǔn)確稱取5.00 g 金銀花粉末(過(guò)三號(hào)篩)于100 mL 離心管中,加入1 g 氯化鈉,立即搖散,再加入50 mL 乙腈,以不低于12 000 r/min 轉(zhuǎn)速勻漿處理2 min,然后離心,取上清液。沉淀物中加入50 mL 乙腈重復(fù)操作,合并兩次提取液,減壓濃縮至約3~5 mL,用乙腈稀釋至10.0 mL,搖勻即得提取液。移取上述提取液3 mL,通過(guò)親水親油平衡材料固相萃取柱(HLB)(200 mg,6 mL)凈化,收集全部?jī)艋海靹?,即得樣品處理液。將上述樣品處理液過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜,取1.0 mL,加入0.01 mL 乙腈,混勻,待測(cè)。
1.2.3 GCB-NH2法
提取液制備方法同1.2.2。移取2 mL 提取液,加入裝有石墨化碳黑氨基復(fù)合固相萃取小柱(500 mg/500 mg,6 mL)[臨用前用乙腈-甲苯混合溶液(體積比為3∶1)10 mL 預(yù)洗],用20 mL 乙腈-甲苯混合溶液(體積比為3∶1)洗脫,搜集洗脫液,減壓濃縮至近干,用乙腈轉(zhuǎn)移并稀釋至2.0 mL,混勻,即得樣品處理液。將上述樣品處理液過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜,取1.0 mL,加入0.01 mL乙腈,混勻,待測(cè)。
35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:移取35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL,置于10 mL 容量瓶中,用乙腈定容至標(biāo)線,混勻。其中α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、艾氏劑、水胺硫磷、α-硫丹、狄氏劑、4,4′-滴滴伊、除草醚、2,4′-滴滴涕、4,4′-滴滴滴、4,4′-滴滴涕、β-硫丹、硫丹硫酸酯、蠅毒磷的質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL,p,p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度為0.4 μg/mL,久效磷、甲基硫環(huán)磷的質(zhì)量濃度均為0.3 μg/mL,內(nèi)吸磷-O、內(nèi)吸磷-S、滅線磷、殺蟲(chóng)脒、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、氟甲腈、甲基對(duì)硫磷、氟蟲(chóng)腈亞砜、氟蟲(chóng)腈、對(duì)硫磷、甲基異柳磷、氟蟲(chóng)腈砜、苯線磷的質(zhì)量濃度均為0.2 μg/mL,o,p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL。
基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:取金銀花空白基質(zhì)樣品,分別按照1.2.1、1.2.2 和1.2.3 方法進(jìn)行處理。取1.0 mL 樣品提取液,各6 份,氮?dú)獯蹈桑謩e加入35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mL,用乙腈定容至1.0 mL,混勻。其中α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、艾氏劑、水胺硫磷、α-硫丹、狄氏劑、4,4′-滴滴伊、除草醚、2,4′-滴滴涕、4,4′-滴滴滴、4,4′-滴滴涕、β-硫丹、硫丹硫酸酯、蠅毒磷的質(zhì)量濃度均分別為5、10、25、50、75、100 μg/L,p,p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度分別為4、8、20、40、60、80 μg/L,久效磷、甲基硫環(huán)磷的質(zhì)量濃度均分別為3、6、15、30、45、60 μg/L,內(nèi)吸磷-O、內(nèi)吸磷-S、滅線磷、殺蟲(chóng)脒、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、氟甲腈、甲基對(duì)硫磷、氟蟲(chóng)腈亞砜、氟蟲(chóng)腈、對(duì)硫磷、甲基異柳磷、氟蟲(chóng)腈砜、苯線磷的質(zhì)量濃度均分別為2、4、10、20、30、40 μg/L,o,p′-三氯殺螨醇的質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、15、20 μg/L。
用“質(zhì)量測(cè)定”方法[15]考察3 種樣品處理方法得到的提取液中共萃取基質(zhì)的含量,即取空白樣品,經(jīng)乙腈提取后未凈化的萃取液為初級(jí)萃取液,經(jīng)不同樣品處理方法凈化后的萃取液為最終凈化液,分別將2 mL 最終凈化液置于已稱重的潔凈試管中,氮?dú)獯蹈珊笥?10 ℃烘箱中干燥至恒重,取出冷卻并稱重,與原試管質(zhì)量差即為共萃取基質(zhì)的含量。
1.5.1 色譜
色譜柱:VF-17 ms 彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;不分流時(shí)間:1 min;載氣:氦氣,純度(體積分?jǐn)?shù))為99.999%;恒壓模式,柱前壓力為146 kPa;程序升溫:初始溫度為60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min 升溫至120 ℃,然后以10 ℃/min 的速率升溫至160℃,再以2 ℃/min 的速率升溫至230 ℃,最后以15℃/min 的速率升溫至300 ℃,保持6 min。
1.5.2 質(zhì)譜
電離方式:電子轟擊(EI)電離模式;電離能量:70 eV;燈絲電流:100 μA;離子源溫度:250 ℃;傳輸線溫度:250 ℃;Q2 碰撞氣:氮?dú)?,純度(體積分?jǐn)?shù))為99.999%;溶劑延遲:7 min;掃描方式:動(dòng)態(tài)多反應(yīng)檢測(cè)(dMRM)模式。Masshunter 10.0 工作站軟件用于儀器控制和數(shù)據(jù)處理。35 種農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
表2 35 種農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)
基于QuEChERS 原則的處理方法所用的凈化材料為無(wú)水硫酸鎂、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)和石墨化碳黑(GCB)。無(wú)水硫酸鎂主要是去除多余水分,增強(qiáng)PSA 的凈化效果,排除水分對(duì)氣相色譜柱的影響;PSA 能有效去除樣品溶液中酸性和極性化合物,如有機(jī)酸、脂肪酸、部分色素及糖類;C18能除去非極性化合物,如揮發(fā)油、萜類、木質(zhì)素、脂類、類胡蘿卜素等;GCB 可以去除大部分色素和甾醇。HLB 法主要是去除樣品中揮發(fā)油、萜類、磷脂等,對(duì)色素去除能力較差。而GCB-NH2法中起凈化作用的主要是NH2—和石墨化碳黑,NH2—與PSA 凈化原理類似,主要去除樣品溶液中極性雜質(zhì),如有機(jī)酸,脂肪酸等。3 種處理方法凈化后的萃取液中共萃取基質(zhì)的質(zhì)量如圖1所示。由圖1 可以看出,基于QuEChERS 原則的處理方法得到的共萃取基質(zhì)含量最高,為0.031 g,這是因?yàn)榇朔椒ㄌ崛r(shí)加入了1%乙酸,水溶性提取物比較多。GCB-NH2法得到的共萃取基質(zhì)含量最低,為0.014 g,而凈化效果比HLB 法好。
圖1 3 種處理方法凈化后的萃取液中共萃取基質(zhì)的質(zhì)量
o,p′-三氯殺螨醇經(jīng)3 種處理方法得到的提取離子色譜圖如圖2 所示。由圖2 可以看出,基于QuEChERS 原則的處理方法對(duì)目標(biāo)物色譜峰的干擾最嚴(yán)重,HLB 法其次,而GCB-NH2法干擾最小。
圖2 o,p′-三氯殺螨醇經(jīng)3 種處理方法得到的提取離子色譜圖
稱取金銀花空白基質(zhì)樣品3.00 g,加入35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液25 μL,按1.2.1 方法平行處理6 份樣品溶液;稱取2 份金銀花空白基質(zhì)樣品,各5.00 g,分別加入35 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液15 μL,分別按1.2.2 和1.2.3 方法各平行處理6 份樣品溶液,在1.5 儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知,基于QuEChERS 原則的處理方法回收率最好,除殺蟲(chóng)脒外其它34 種農(nóng)藥回收率均在72.9%~110.9%范圍內(nèi);GCB-NH2法其次,除兩種內(nèi)吸磷外,其它33 種農(nóng)藥回收率均在68.4%~101.8%范圍內(nèi);HLB 法回收率稍差,有31 種農(nóng)藥回收率在67.4%~112.5%范圍內(nèi),回收率較差的主要是3 種滴滴涕農(nóng)藥和殺蟲(chóng)脒,其中4,4′-滴滴伊回收率為53.6%,2,4′-滴滴涕回收率為55.2%,4,4′-滴滴涕回收率為57.2%,殺蟲(chóng)脒回收率為56.1%。
表3 3 種處理?xiàng)l件下35 種農(nóng)藥加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
基于QuEChERS 原則的處理方法是近幾年比較熱門(mén)的一種樣品處理方法[16-17],此方法不需要對(duì)溶劑進(jìn)行大量濃縮,無(wú)需購(gòu)買固相萃取裝置,對(duì)于沒(méi)有條件購(gòu)置大量自動(dòng)化處理設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室比較適合,但是此方法主要為手動(dòng)操作、過(guò)程繁瑣,凈化不徹底,易導(dǎo)致目標(biāo)物出峰不理想,殺蟲(chóng)脒易被凈化材料PSA 吸附造成其回收率偏低,另外也會(huì)加快儀器污染和維護(hù)頻率,增加儀器維護(hù)成本。此方法一個(gè)樣品只能制備2 mL 凈化液,若要配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,需要同時(shí)處理3 個(gè)空白樣品,費(fèi)時(shí)費(fèi)工。
HLB 法不需要活化和洗脫,固相萃取操作相對(duì)簡(jiǎn)便、快速,親水親油材料由于去除揮發(fā)油類物質(zhì)效果較好,適合含揮發(fā)油較高的中藥材,因此對(duì)于一般的藥材均可以用此法處理。不足之處在于此方法較其它兩種方法回收率稍差,對(duì)于一些含有較強(qiáng)極性物質(zhì)的中藥材,如延胡索、丹參處理效果較差,使多種化合物靈敏度降低,甚至在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰。
GCB-NH2法的優(yōu)點(diǎn)在于去除色素效果較好,回收率也比HLB 法稍佳,不足之處在于操作較復(fù)雜,固相萃取過(guò)程中需要活化和洗脫,固相萃取完以后需要進(jìn)一步濃縮,耗時(shí)較長(zhǎng),而且用到甲苯等毒性較強(qiáng)的有機(jī)試劑。對(duì)一些揮發(fā)油含量特別高的中藥材,如廣藿香、厚樸、木香等處理效果不佳,部分化合物在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰,襯管和色譜柱也會(huì)由于樣品中揮發(fā)油的存在受到污染,從而增加儀器維護(hù)成本。
以上3 種處理方法各有優(yōu)缺點(diǎn),而中藥材種類繁多,每種中藥材成分理化性能差異較大,很難建立一種統(tǒng)一的樣品處理方法。筆者通過(guò)對(duì)200 種中藥材的處理方法進(jìn)行摸索,建立了不同中藥材樣品處理方法數(shù)據(jù)庫(kù),見(jiàn)表4。由表4 可知,大部分中藥材用3 種處理方法均可以得到滿足要求的檢測(cè)結(jié)果,但是部分中藥材只能選擇其中一種或兩種方法進(jìn)行處理。含揮發(fā)油多的樣品,如廣藿香,用HLB 法可以得到比較理想的結(jié)果,但是采用GCB-NH2法會(huì)導(dǎo)致大部分化合物在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰。含極性物質(zhì)較多的中藥材,如延胡索和丹參,只能用石墨化碳黑氨基復(fù)合柱法進(jìn)行處理,否則多種農(nóng)藥在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)不出峰,具體原因有待進(jìn)一步研究。含揮發(fā)油和有機(jī)酸較多的中藥材,如厚樸、木香、沉香、沒(méi)藥、司卡摩尼亞脂、花椒等,優(yōu)先選擇用HLB 與GCB-NH2相結(jié)合的方法,若單用石墨化碳黑氨基復(fù)合柱法會(huì)導(dǎo)致氟蟲(chóng)腈類物質(zhì)、六六六、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、三氯殺螨醇、甲基異柳磷和甲基硫環(huán)磷等物質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)出峰不理想。另外,值得關(guān)注的是大部分基質(zhì)中農(nóng)藥化合物保留時(shí)間均比較穩(wěn)定,只有某幾種基質(zhì)中的氟蟲(chóng)腈類物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間后移的現(xiàn)象,如厚樸、木香和細(xì)辛等基質(zhì)中的氟蟲(chóng)腈類物質(zhì),具體原因有待進(jìn)一步研究。
表4 200 種藥材前處理方法推薦
基于QuEChERS 原則的處理方法回收率最好,但是過(guò)程操作較繁瑣,基質(zhì)干擾較大;親水親油平衡材料(HLB)固相萃取法操作相對(duì)較簡(jiǎn)便,對(duì)揮發(fā)油類含量較多的中藥材處理效果較理想,但是回收率稍差;石墨化碳黑氨基復(fù)合柱法除色素能力最強(qiáng),基質(zhì)凈化效果最佳,但是對(duì)揮發(fā)油類物質(zhì)不理想,且過(guò)程操作較復(fù)雜。由于中藥材品種繁多,每種中藥材成分理化性能差異較大,不能籠統(tǒng)地建立一種適合所有中藥材農(nóng)藥檢測(cè)的處理方法,因此應(yīng)根據(jù)所檢測(cè)的中藥材的理化特性選擇合適的處理方法。