王 爽,閆 艷(山西省中醫(yī)院藥劑科,太原 0300;山西大學中醫(yī)藥現代研究中心;通訊作者,E-mail:yanyan50@sxu.edu.cn)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子,用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴等證[1],具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗焦慮、抗氧化等廣泛的藥理活性[2]。在各類治療失眠的中藥制劑中,酸棗仁是最常用的組分。酸棗仁化學成分較清晰,迄今國內外學者已從酸棗仁中分離鑒定出131余種化合物種。黃酮是酸棗仁中含量高且具有活性的一類成分[3]。趙啟鐸等[4]采用小鼠強迫游泳實驗和懸尾實驗等抑郁模型表明酸棗仁黃酮具有抗抑郁活性。Liu等[5]研究表明酸棗仁中主要的黃酮類成分斯皮諾素具有焦慮樣作用,其作用機制與調節(jié)GABAA和5-HT1A受體有關。因此有必要制備純度高的酸棗仁總黃酮,并建立一種靈敏、高效和準確的含量測定方法用于酸棗仁的質量控制,為從酸棗仁總黃酮研發(fā)具有改善睡眠、抗焦慮等作用的藥效成分提供物質基礎。

超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱串聯質譜(UPLC-QTRAP-MS)技術是研究中藥復雜成分的一種有效、可行的分析方法。其多反應監(jiān)測-觸發(fā)增強-子離子掃描(MRM-IDA-EPI)掃描模式,可以實現一次進樣,得到用于定量的MS色譜圖和用于定性的高質量的MS2質譜圖,大大排除了假陽性結果[6],適合于中藥復雜體系化學成分的定性和定量分析。本實驗首先采用正丁醇萃取與大孔樹脂相結合的方法提取純化制備酸棗仁總黃酮;其次,建立基于MRM-IDA-EPI模式的LC-MS/MS定性和定量分析當藥黃素、維采寧Ⅱ、牡荊素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、斯皮諾素、異牡荊素、6?-阿魏酰斯皮諾素和蘆丁的方法,并應用于酸棗仁總黃酮中7種成分的含量測定,為后期藥效學和藥動學研究提供實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1290超高液相色譜系統(tǒng),包括四元輸液泵,自動進樣器等(美國Agilent公司);3200Q-Trap型質譜儀,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.5.2數據處理軟件(美國AB Sciex公司);CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius北京儀器系統(tǒng)有限公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 材料

酸棗仁購于河北省安國市嘉潤中藥材有限公司,經山西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室杜晨暉教授鑒定為為鼠李科植物酸棗ZiziphsujujubeMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou的成熟干燥種子。

對照品當藥黃素(批號20170216)、斯皮諾素(批號20160314)、6?-阿魏酰斯皮諾素(批號20160313)均購于寶雞市辰光生物科技有限公司;山奈酚-3-O-蕓香糖苷(批號6150)、維采寧Ⅱ(批號3922)均購于上海詩丹德生物技術有限公司;異牡荊素(Y-116-171222)購于成都瑞芬思生物科技有限公司;蘆丁(批號C1424058)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,以上對照品經HPLC歸一化法測定質量分數均大于98%。甲醇、乙腈為色譜純,均購于Fisher公司,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 酸棗仁總黃酮的制備

取酸棗仁藥材約2 300 g,粉碎(過1號篩),加10倍體積石油醚浸泡過夜,加熱回流提取2次,每次1 h,進行脫脂;濾過,藥渣干燥并稱重,加10倍體積70%乙醇浸泡4 h,加熱回流提取2次,每次2 h,合并濾液,減壓濃縮至無醇味,得濃度為1 g/ml(按生藥量計)的濃縮液。濃縮液用水飽和正丁醇萃取4次(1 ∶1),合并萃取液,先減壓濃縮,再水浴蒸制得浸膏,其得率為2.4%。

將浸膏用蒸餾水溶解至0.5 g生藥/ml,上樣到體積為2 L的D101大孔樹脂上,分別用5倍柱體積(10 L)的水除去糖類等雜質、再用10%乙醇除雜、30%乙醇洗脫,收集洗脫液,蒸干(得率0.4%)。以斯皮諾素為對照,紫外分光光度法測定總黃酮純度為58%。

2.2 供試品溶液的制備

稱取酸棗仁總黃酮凍干粉約10 mg,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加70%甲醇10 ml,稱定質量,超聲處理20 min,放置室溫,用70%甲醇補足減失的重量,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 對照品溶液的制備

取對照品適量,精密稱定,加70%的甲醇制備成斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素濃度為1 mg/ml的單一對照品儲備液,加70%的甲醇制備成當藥黃素、維采寧Ⅱ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異牡荊素、蘆丁濃度均為0.05 mg/ml的單一對照品溶液,分別精密吸取上述對照品儲備液適量加甲醇制成混合對照品儲備液。

2.4 色譜及質譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:MRM負離子掃描;源噴射電壓(IS)為-4 500 V;霧化溫度:550 ℃;氣簾氣(Curtain gas,N2):40.0 psi;霧化氣(GS1,N2):50 psi;輔助氣(GS2,N2):50 psi。MRM-IDA-EPI模式:IDA參數:Select 1 to 1 most intense peaks;選擇動態(tài)背景扣除(Alter Dynamic Background Subtraction of Survey scan);閾值(Which exceeds):500 cps;質量偏差(Mass Tolerance):250 mDa。EPI參數設置為掃描范圍:50～950 Da;掃描速率(Scan rate):1 000 Da/s;離子阱動態(tài)填充(Dynamic fill time);DP:-60 V;EP:-10 eV;CES:( -40 ±10)eV。

2.5 提取溶劑的選擇

以斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素2個黃酮類成分為指標,采用已建立的分析方法[7],分別比較了50%乙醇、60%乙醇和70%乙醇提取效果,結果顯示,70%乙醇作為提取溶劑時,斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素的峰面積最高(見表1),因此,選擇70%乙醇作為提取溶劑。

表1 提取溶劑的考察

2.6 定性和定量分析

按“2.4”項下色譜和質譜條件,分別對7個化合物進行增強子離子(EPI)參數的優(yōu)化,獲得高質量的二級碎片信息(見表2)。在負離子模式下,斯皮諾素失去C4H8O4(120 D)生成碎片離子m/z487或失去一分子葡萄糖(Glu)生成碎片離子m/z445(見圖1)。m/z445進而失去一分子H2O生成m/z427,繼而丟失C2H2O4生成碎片離子m/z337;碎片離子m/z427失去C4H8O4生成m/z307,并進一步失去CH3生成m/z292的碎片離子。當藥黃素、維采寧Ⅱ、異牡荊素和6?-阿魏酰斯皮諾素均為黃酮C糖,與斯皮諾素裂解方式相似,通過與對照品和文獻比對,進行鑒別[7]。山奈酚-3-O-蕓香糖苷和蘆丁均為氧糖,均直接脫掉糖,生成相應的苷元(見圖1)。

在化合物鑒定的基礎上,對7個進行定量分析,7個成分的MRM色譜圖見圖2。

表2 七種成分的保留時間和質譜分析參數

2.7 方法學考察

2.7.1 線性關系考察 精密量取上述混合對照品溶液適量,用70%甲醇逐級稀釋成含有當藥黃素濃度為0.025,0.2,0.4,0.6,0.8,1 μg/ml,維采寧Ⅱ濃度為0.125,1,2,3,4,5 μg/ml,山奈酚-3-O-蕓香糖苷濃度為0.04,0.8,1.6,2.4,3.2,4 μg/ml,斯皮諾素濃度1,12,24,36,48,60 μg/ml,異牡荊素濃度為0.05,0.2,0.4,0.6,0.8,1 μg/ml,6?-阿魏酰斯皮諾素濃度為1.5,6,12,18,24,30 μg/ml,蘆丁濃度為0.05,0.4,0.8,1.2,1.6,2 μg/ml的混合對照品溶液。按“2.4”項下色譜和質譜條件分析,以指標成分的峰面積為縱坐標(Y),質量濃度為橫坐標(X),進行線性回歸,得回歸方程、相關系數(r)和線性范圍,結果7種指標成分的質量濃度和峰面積的相關系數均大于0.999 5(見表3),表明該方法線性關系良好。

2.7.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液2 μl,按“2.4”項下色譜和質譜條件重復進樣6次,考察儀器日內精密度。同一混合對照品溶液連續(xù)進3 d,計算儀器日間精密度,其峰面積的RSD值均小于3%(見表4),表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批酸棗仁總黃酮粉末樣品,約4 mg,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,于室溫放置0,2,4,6,12,24 h后按色譜質譜條件進樣,以峰面積進行分析,計算7種指標成分峰面積的RSD值,均小于3%(見表4),表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

圖1 MRM-IDA-EPI模式下酸棗仁總黃酮7種化合物定性EPI圖譜Figure 1 EPI chromatograms of seven compounds of total flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen under MRM-IDA-EPI mode

2.7.4 重復性試驗 取同一批酸棗仁總黃酮樣品粉末6份,每份約4 mg,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4”項下色譜和質譜條件進樣分析,分別記錄7種指標成分當藥黃素、維采寧Ⅱ、牡荊素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、斯皮諾素、異牡荊素、6?-阿魏酰斯皮諾素,蘆丁的峰面積,計算其質量分數分別為0.20%,0.97%,0.03%,1.3%,21.4%,0.19%,7.6%,0.4%,其RSD結果均小于3%(見表4),表明提取方法的精密度良好。

圖2 對照品和酸棗仁總黃酮樣品的MRM定量離子對色譜圖Figure 2 MRM quantitative ion pair chromatograms of reference substance and total flavonoids

表3 七種成分的回歸方程、相關系數、線性范圍

表4 七種成分的精密度、穩(wěn)定性、重復性 (%)

2.7.5 加樣回收率試驗 稱取已知7個成分含量的酸棗仁總黃酮樣品6份,每份約2 mg,分別精密加入與樣品中7種成分含量相當的混合對照品溶液,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4”項下色譜和質譜條件進樣分析,記錄指標成分的峰面積,計算其平均加樣回收率及相應的RSD值。當藥黃素、維采寧、牡荊素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、斯皮諾素、異牡荊素、6?-阿魏酰斯皮諾素、蘆丁的平均回收率分別為97.92%,95.87%,102.32%,106.11%,101.23%,97.45%和92.03%;RSD值分別為2.53%,2.68%,1.52%,1.91%,1.65%,2.64%和2.75%,表明提取方法的準確度良好。

2.7.6 樣品測定 取制備的3批樣品,按照“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4”項下色譜和質譜條件進樣分析,當藥黃素、維采寧、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、斯皮諾素、異牡荊素、6?-阿魏酰斯皮諾素和蘆丁的平均含量分別為(1.95 ±0.05)mg/g,(9.66 ±0.18)mg/g,(12.71 ±0.15)mg/g,(214.35 ±1.66)mg/g,(1.86 ±0.05)mg/g,(78.02 ±1.21)mg/g和(3.98 ±0.10)mg/g。由此可見,酸棗仁總黃酮的提取制備工藝穩(wěn)定,樣品含量穩(wěn)定可控。

3 討論

黃酮類化合物是酸棗仁的主要活性成之一。斯皮諾素及6?-阿魏酰斯皮諾素作為主要的黃酮類成分,具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗焦慮、抗氧化以及提高記憶力等功效的作用[8]。此外,研究表明當藥黃素有改善認知功能[9],維采寧Ⅱ具有抗前列腺癌的作用[10];異牡荊素具有抗氧化、抗菌和調節(jié)記憶等功能[11]。黃酮氧糖山奈酚-3-O-蕓香糖苷對缺血性腦梗塞具有潛在的治療作用,并對神經細胞具有一定的保護作用[12];蘆丁具有抗氧化及抑菌等作用[13]。本研究以酸棗仁總黃酮為研究對象,首先對制備酸棗仁總黃酮的最佳提取溶劑、萃取劑及純化洗脫梯度進行了考察,70%乙醇作為提取溶劑時,兩個主要化學成分斯皮諾素及6?-阿魏酰斯皮諾素的峰面積較高,因此,選擇70%作為提取溶劑。進而采用水飽和正丁醇作為萃取劑,并收集30%乙醇洗脫部位,最終得到百分含量為58%的酸棗葉總黃酮。

酸棗仁總黃酮中含有大量的同分異構體[2]。參考課題組前期分析酸棗仁的色譜條件[14],并在此基礎上進行優(yōu)化,實現了對當藥黃素和異當藥黃素、斯皮諾素和異斯皮諾素、木荊素和異牡荊素三對同分異構體的分離,為各成分的精確定量提供了前提。其次,利用針泵進樣優(yōu)化了當藥黃素、維采寧Ⅱ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、斯皮諾素、異牡荊素、6?-阿魏酰斯皮諾素和蘆丁7個對照品并MRM質譜條件。分別優(yōu)選了最佳定量離子對,并考察了定量離子對的最佳去簇電壓(DP)及碰撞能量(CE)。當MRM信號低于IDA設定的閾值500 cps時,只進行MRM掃描;當MRM信號大于IDA設定的閾值500 cps時同時啟動線性離子阱的EPI功能。為了得到豐富的二級碎片信息,繼而對EPI參數進行優(yōu)化,結果表明,當EPI中DP為-60 V、CES為(-40 ±10)eV時,7個化合物的碎片離子最豐富。

本研究制備了純度為58%酸棗仁總黃酮提取物;建立了一種能同時定性和定量7個黃酮的LC-MS/MS分析方法。該方法重復性好、分析速度快,準確度高,可應用于酸棗仁總黃酮定性定量分析,為后期藥效學和藥動學研究提供了穩(wěn)定、可控的物質基礎。