楊洪賓,余真妍,閆 潔,紀帥帥,楊夢婷,胡 嫚,王子吟,霍 強,程 秀(蚌埠醫(yī)學院藥學院藥物化學教研室,蚌埠 233000;通訊作者,E-mail:620793985@qq.com;共同通訊作者,E-mail:93703312@qq.com)

肺癌是嚴重威脅人們健康的惡性腫瘤之一[1]?；熑匀皇侵饕闹委煼绞?但是化療藥物具有水溶性低、穩(wěn)定性差等缺點,嚴重影響各種化療藥物的應用[2]。例如,槲皮素是一種來源廣泛的黃酮醇類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗菌等多重作用,但同樣存在上述弊端[3,4]。目前研究多采用納米靶向制劑搭載化療藥物,增強藥物到達病灶的有效濃度[5]。例如,Gui等[6]制備了超順磁性氧化鐵納米粒子,優(yōu)化了紫杉醇的不良性質,避免了藥物過早的破壞,提高了藥物的靶向富集。但常規(guī)的靶向制劑仍然存在易被體內吞噬系統識別破壞和靶向性不足等缺點[7]。目前,通過細胞膜包裹構建仿生納米載體可以進一步解決上述存在的不利之處。從最初利用紅細胞膜[8]包裹納米粒子進行給藥,避免巨噬細胞的攝取,延長藥物體循環(huán)時間,到后來利用巨噬細胞[9]、中性粒細胞[10]、T細胞[11]、癌細胞[12]與細菌[13]等提取細胞膜用于包裹粒子構建仿生納米載體。其中,癌細胞膜有別于其他膜材料,具有很好的同源靶向性和逃避免疫系統識別能力,作為仿生膜材料具有獨特的優(yōu)勢[14]。其次,沸石咪唑骨架(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)是金屬有機骨架(MOFs)的一個重要亞類,以其優(yōu)異的載藥量和pH響應性,被確認為一種性能優(yōu)越的載體,并被廣泛用于藥物的靶向遞送[15]。因此,本研究通過肺癌細胞膜(lung cancer cell membrane,CM)包裹咪唑骨架材料構建仿生藥物,旨在探討仿生類的材料能否發(fā)揮隱形作用和腫瘤靶向作用,從而為肺癌的治療構建一種能夠良好靶向腫瘤部位發(fā)揮療效的仿生納米載體。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

肺癌細胞株A549細胞(中國上?？茖W院);BALB/c裸鼠(常州卡文斯實驗動物有限公司);槲皮素、六水合硝酸鋅(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);2-甲基咪唑(東京化成工業(yè)株式會社,日本);0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Gibco,美國);F12培養(yǎng)基(大連美侖生物科技有限公司);胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司);青霉素-鏈霉素溶液、細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司);Matrigel基質膠(Corn-ing,美國);Cy5熒光染料(上海經科化學科技有限公司)。

1.2 動物與細胞培養(yǎng)

A549細胞在含10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng),37 ℃,5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5周齡的BALB/c雄性裸鼠飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心,并獲得蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心倫理批準。

1.3 仿生納米載體的構建

1.3.1 提取A549細胞膜 細胞刮收集A549細胞,離心棄上清(900 r/min,5 min,4 ℃),用預冷的PBS清洗3次。取細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒中的試劑A 1 ml重懸細胞,冰浴15 min后,細胞懸液反復凍融3次。離心取上清(700 r/min,10 min,4 ℃),將上清離心(14 000 r/min,30 min,4 ℃),所得沉淀即為癌細胞膜,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 制備CMD-ZIF-8@QT 根據先前報道的方法[16]采用一鍋包封法制備載藥納米粒子,取970 mg的二甲基咪唑,50 mg的槲皮素溶于10 ml甲醇中,攪拌5 min,使其充分混合,另取50 mg的六水合硝酸鋅溶于5 ml甲醇中,并將六水合硝酸鋅逐滴加入到上述溶液中攪拌2 h,之后10 000 r/min,10 min,4 ℃離心,棄上清,甲醇浸洗2次,去離子水浸洗2次。凍干得ZIF-8@QT。將CM、二硬脂酰基乙醇胺(distearoyl phosphoethanolamine,DSPE)與ZIF-8@QT按照質量比1 ∶2 ∶5混合,水浴超聲30 min(200 W,40 kHz)。9 000 r/min,10 min,4 ℃離心,甲醇浸洗2次,去離子水浸洗2次,凍干得CMD-ZIF-8@QT。

1.4 仿生納米載體的表征

1.4.1 用動態(tài)光散射系統(DLS)檢測ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的粒徑與Zeta電勢 取空白ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的納米顆粒溶液,適度稀釋后,置于馬爾文四通石英樣品池中,采用DLS Zetasizer Nano-90測量樣品的粒徑和Zeta電勢,每次測量重復3次。

1.4.2 用透射電鏡(TEM)檢測ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的結構 制備適宜濃度的ZIF-8、ZIF-8@QT和CMD-ZIF-8@QT的納米粒溶液,分別取10 μl滴加在200目有碳支持膜的銅網上,常溫放置2 h,干燥后用透射電子顯微鏡觀察樣品的結構。

1.4.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 將ZIF-8@QT、A549肺癌細胞膜與CMD-ZIF-8@QT按一定比例與上樣緩沖液混合均勻,95 ℃加熱5 min使蛋白變性。將樣品和蛋白Marker按順序依次緩慢加入到含有預先配置的凝膠加樣孔中,進行電泳(先75 V 30 min,后100 V 60 min),電泳結束后,取出凝膠,用快速考馬斯亮藍染色液染色30 min,脫色2 h后,拍照并分析。

1.5 CMD-ZIF-8@QT的制劑學評價

1.5.1 標準曲線的制備 精密稱取一定質量的槲皮素,用甲醇溶解配制成1 mg/ml的溶液,稀釋成2.8,4.4,5.8,7.5,9,10.8 μg/ml的槲皮素標準工作液。用紫外分光光度計測定標準工作液在370 nm波長處的吸光度,并繪制標準曲線。

1.5.2 包封率與載藥量的測定 按1.5.1所述方法制備出CMD-ZIF-8@QT,取二甲基咪唑1 940 mg,六水合硝酸鋅25 mg,槲皮素的投藥量分別為2.4,5.2,9.8,25.4,30.2,40.4,50.6 mg,將所得納米粒離心(9 000 r/min,5 min),去除上清中未被包封的槲皮素。用紫外分光光度計測定上清溶液在371 nm波長處的吸光度,根據槲皮素溶液的標準曲線,計算出游離藥物質量。按以下公式計算包封率(encapsulation efficiency,EE)和載藥量(drug loading content,DLC):

EE(%)=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%

DLC(%)=(Wtotal-Wfree)/Ntotal

其中,Wtotal是系統中的藥物總質量;Wfree是溶液中游離的藥物質量,Ntotal是總納米粒的質量。

1.5.3 酸響應釋藥分析 在pH 5.0與pH 7.4的PBS中研究CMD-ZIF-8@QT的釋藥性,將2 ml的ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT溶液裝入3 500 D的透析袋中,每個透析袋放入裝有30 ml釋放介質的50 ml燒杯中,37 ℃搖床,100 r/min,在預定時間點1,2,5,10,15,20,30,60,80 h后,取出透析袋,用移液槍吸取1 ml釋放液,并加入等體積的釋放介質,采用上述紫外法測定QT的釋放量,釋放實驗重復3次。

1.5.4 CMD-ZIF-8@QT的穩(wěn)定性實驗 將新制的CMD-ZIF-8@QT粒子,分別置于等體積的0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液和含有10% FBS的0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液中,在預定時間點0,6,12,18,24,36,48 h取出透析袋,用移液槍收集1 ml溶液,同時補入等量的釋放介質,將收集的溶液用馬爾文粒徑儀檢測粒徑和電勢,重復3次。

1.6 CMD-ZIF-8@QT的體內評價

1.6.1 CMD-ZIF-8@QT體內分布實驗 在雄性BALB/c裸鼠右側皮下注射100 μl(1×106個A549細胞)預冷的PBS溶液,待腫瘤長至200 mm3左右時,尾靜脈注射Cy5與Cy5-CMD-ZIF-8并將其分為對照組和Cy5-CMD-ZIF-8組。分別于注射后1,6,12,24 h采用小動物活體成像儀測量腫瘤部位的熒光強度,觀察結束后解剖小鼠取臟器和腫瘤,并測量各個臟器和腫瘤組織內的熒光強度,進行ROI半定量分析。

1.6.2 CMD-ZIF-8@QT在動物體內的藥效實驗 在4～5周齡的雄性BALB/c小鼠右側皮下注射100 μl(1×106個A549細胞)預冷的PBS溶液。待腫瘤長至100 mm3左右時,將小鼠隨機分為生理鹽水組(saline)、QT組、ZIF-8@QT組與CMD-ZIF-8@QT組,每組5只。以5 mg/kg藥物劑量尾靜脈注射藥物。每3 d給藥1次,每2 d測量記錄腫瘤的體積,每3 d記錄裸鼠的體質量,第1次給藥當天記為0 d,于第21天處死小鼠,取出臟器進行HE染色。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 仿生納米載體的表征

2.1.1 動態(tài)光散射系統(DLS)檢測結果 QT與CMD均帶負電荷,ZIF-8因表面的Zn2+帶正電荷,首先將藥物QT包封進ZIF-8,結果顯示,粒子的Zeta電勢由正變負,同時粒徑由(127.3 ±2.23)nm增長到(145.2 ±3.24)nm。將帶負電荷的脂質類混合膜材料與ZIF-8@QT結合,結果顯示,Zeta電勢絕對值進一步增大,粒徑由(145.2 ±3.21)nm增長到(176.4 ±2.72)nm。因此初步得出QT成功載入ZIF-8和CMD包封ZIF-8@QT粒子(見圖1)。

2.1.2 透射電鏡(TEM)結果 TEM結果表明,ZIF-8、ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8的粒徑結果分別為(85.3 ±3.22)nm,(96.2 ±2.73)nm,(109.3 ±3.71)nm。在納米粒的整個制備過程中,納米粒形貌由多面體形變?yōu)轭惽蛐?且納米粒的粒徑逐漸增大(見圖2)。

2.1.3 SDS-PAGE 結果表明,ZIF-8作為金屬有機骨架材料,在凝膠上不存在蛋白印跡;CMD存在完整的蛋白印跡;與CMD電泳條帶相比,CMD-ZIF-8@QT的蛋白印跡位置大致相同,條帶顏色相似(見圖3),說明兩者含有相同的蛋白成分,即癌細胞膜在制備和超聲包覆的過程中,蛋白很好地保留下來。

圖1 ZIF-8,ZIF-8@QT,CMD-ZIF-8@QT的表征圖Figure 1 Characterization of ZIF-8,ZIF-8@QT, CMD-ZIF-8@QT

圖2 ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的透射電鏡形貌與粒徑結果圖Figure 2 Morphology and particle size of ZIF-8, ZIF-8@QT and CMD-ZIF-8@QT under transmission electron microscope

2.2 CMD-ZIF-8@QT的制劑學評價

2.2.1 標準曲線的制備 以QT濃度x對吸光度y

1.ZIF-8;2.CMD;3.CMD-ZIF-8@QT圖3 SDS-PAGE的蛋白印跡結果Figure 3 SDS-PAGE of ZIF-8, CMD and CMD-ZIF-8@QT

作圖,進行線性回歸,得到標準曲線回歸方程?；貧w方程為y=0.057 9x-0.011,R2=0.999,槲皮素的濃度在1～10 μg/ml的范圍內線性關系良好(見圖4)。

圖4 QT的標準曲線Figure 4 Standard curve of QT

2.2.2 包封率與載藥量的測定 結果表明,ZIF-8在加入低質量的QT時,具有較高的包封率和較低載藥量,且隨著QT質量的增加,包封率明顯下降,載藥量增加不明顯。綜合不同質量的QT對ZIF-8納米粒包封率和載藥量的影響,QT的加入量確定為15 mg,此時具有較高的包封率和載藥量,包封率和載藥量分別為84.2% ±1.42%和16.8% ±0.64%(見圖5)。

圖5 包封率與載藥量隨著QT的給藥劑量變化趨勢圖Figure 5 Change trend of encapsulation efficient and drug loading content with the dose of QT

2.2.3 酸響應釋藥 結果表明,CMD-ZIF-8@QT在正常生理pH條件下是穩(wěn)定的,在酸性的環(huán)境中,ZIF-8中的2-甲基咪唑和Zn2+之間的配位鍵會被破壞,導致ZIF-8裂解,從而實現藥物的釋放。在pH 5.0的條件下,孵育15 h,有高達88.6% ±1.6%的QT從CMD-ZIF-8@QT載體中釋放出來,而在pH 7.4的條件下,15 h僅有8.1% ±2.3%的QT釋放出來(見圖6)。因此,得出仿生納米載藥系統CMD-ZIF-8@QT在正常生理條件下pH是穩(wěn)定的,并具有良好的酸敏感性。

2.2.4 CMD-ZIF-8@QT的穩(wěn)定性實驗 采用pH 7.4 PBS溶液和含有10% FBS的pH 7.4 PBS溶液模擬體內正常生理環(huán)境,考察CMD-ZIF-8@QT在48 h內納米粒的穩(wěn)定性。結果表明,CMD-ZIF-8@QT在PBS溶液中48 h內能保持其穩(wěn)定性,粒徑小幅度增加,表明穩(wěn)定性良好。在含有10% FBS的pH 7.4 PBS溶液,納米載體由于FBS中含有一些蛋白質和無機物,粒徑整體略大于在PBS溶液中的粒徑(見圖7)。因此,可知CMD-ZIF-8@QT納米粒子在體內遞送時具有一定的穩(wěn)定性。

圖6 CMD-ZIF-8@QT在pH 5.0與pH 7.4條件下的QT累積釋放情況Figure 6 QT cumulative release of CMD-ZIF-8@QT under pH 5.0 and pH 7.4

圖7 CMD-ZIF-8@QT在PBS和含10% FBS的PBS中的穩(wěn)定性Figure 7 Stability of CMD-ZIF-8@QT in PBS and PBS containing 10% FBS

2.3 CMD-ZIF-8@QT的體內評價

2.3.1 CMD-ZIF-8@QT體內分布實驗 結果表明,注射Cy5與Cy5-CMD-ZIF-8后,熒光大部分聚集于肝臟,與對照組相比,Cy5-CMD-ZIF-8組在腫瘤部位表現出較強的熒光,用小動物活體成像系統進一步ROI半定量分析,發(fā)現Cy5-CMD-ZIF-8組具有較好腫瘤組織靶向性和聚集性(P<0.01,見圖8)。

2.3.2 CMD-ZIF-8@QT在動物體內的藥效實驗 結果表明,CMD-ZIF-8@QT組與QT組相比在體內抑制腫瘤效果方面差異有統計學意義(P<0.01),藥物對腎臟無明顯影響(見圖9)。因此,得出構建了一種可以增強藥物的抗腫瘤效果,并且對小鼠的肝腎無明顯影響的藥物遞送系統。

B.Cy5-CMD-ZIF-8離體心、肝、脾、肺、腎與腫瘤的熒光分布 與對照組相比,* *P<0.01圖8 CMD-ZIF-8在體內分布情況Figure 8 Distribution of CMD-ZIF-8 in vivo

圖9 CMD-ZIF-8@QT的抗腫瘤作用Figure 9 Anti-tumor effect of CMD-ZIF-8@QT

3 討論

最近,研究者從紅細胞、免疫細胞、腫瘤細胞獲取仿生材料進行納米藥物研究已成為研究熱點,其中2種或2種以上細胞膜混合得到性能更優(yōu)越的納米靶向載體也開始成為研究方向。例如,Long等[17]構建的紅細胞膜和癌細胞膜雜交后與酸敏感脂質體結合的復合遞藥系統,Hao等[18]利用靶向多肽修飾紅細胞膜包裹ZIF-8等都是采用仿生材料作為遞藥系統的典型。但是,復雜的仿生遞藥系統不僅帶來更多的不穩(wěn)定性,也帶來工藝復雜性和工業(yè)化生產成本高昂的弊端[19]。

在本研究的合成工藝中,納米藥物外層包裹混合膜材料后,粒子接近類球形,提高了納米藥物在體內的流動性,有利于載體藥物在體內的遞送。動物實驗中,與其他組相比,CMD-ZIF-8@QT組抑瘤效果明顯,并且治療結束后,與對照組相比,CMD-ZIF-8@QT組肝腎的HE染色結果無明顯差異,這表明癌細胞膜的修飾不僅增強了藥物的腫瘤靶向性,顯著抑制腫瘤生長,同時,藥物CMD-ZIF-8@QT對肝腎功能均無明顯損害,確保了仿生藥物的用藥安全性。另外,仿生藥物能夠有效抑制腫瘤體積,這也提示癌細胞表面可能保留了多種腫瘤相關抗原分子,當其被抗原呈遞細胞攝取時,提高腫瘤的適應性免疫反應,最終抗腫瘤作用大大增強,其相關具體免疫機制有待進一步研究。

總之,本研究通過簡單的工藝將癌細胞膜與DSPE混合制成混合膜修飾在ZIF-8@QT表面,成功制備出一種仿生納米藥物,其不但提高了QT的抗腫瘤效果,而且減小了藥物對肝腎的毒副作用,使藥物的安全性得到改善,也為藥物的仿生化提供了參考依據。