汪 靜,項金慧,周亞蘭(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院麻醉科,上海 201203;通訊作者,E-mail:zhouio11601@126.com)

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種高選擇性的α2-腎上腺素能受體(α2-adrenergic receptors,α2-ARs)激動劑,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、交感神經(jīng)及血流動力學(xué)穩(wěn)定性,且過量服用也不會抑制呼吸,目前已廣泛應(yīng)用于臨床[1,2]。右美托咪定的作用機(jī)制與疼痛信號通路中α2-AR的廣泛分布有關(guān),包括初級傳入神經(jīng)和脊髓背角,現(xiàn)已證實α2-ARs不僅可在全身給藥時產(chǎn)生鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛作用,還可通過硬膜外腔及周圍神經(jīng)周圍給藥產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用[3,4]。除α2-ARs外,許多配體門控及電壓門控離子通道也在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等初級感覺神經(jīng)元中表達(dá),將有害刺激轉(zhuǎn)化為上行傷害性信號[5],這些離子通道的調(diào)控可能是DEX抵抗外周傷害的潛在機(jī)制[5]。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是配體門控離子通道,由細(xì)胞外質(zhì)子直接門控,在神經(jīng)系統(tǒng)中水平表達(dá)較高,負(fù)責(zé)產(chǎn)生酸誘發(fā)電流并充當(dāng)pH傳感器,導(dǎo)致神經(jīng)元興奮,在痛覺、恐懼行為等方面起著重要作用[6,7]。ASIC,尤其是ASIC3,是酸中毒所致相關(guān)疼痛的主要參與者,與患者疼痛相關(guān),提示ASICs有可能成為鎮(zhèn)痛藥的潛在作用靶點[8]。而α2-ARs和ASICs都存在于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中,二者間可能存在某種相關(guān)性。本實驗通過研究ASICs是否參與了右美托咪定調(diào)節(jié)疼痛的過程,并對α2-ARs與ASICs間的關(guān)系進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞培養(yǎng)

選取7～8周齡的SD大鼠24只,體質(zhì)量260～320 g。麻醉后脫頸、斷頭處死,取出胸腰段脊柱,將其迅速轉(zhuǎn)移至解剖液中,置于4 ℃環(huán)境下保存,并用手術(shù)剪將神經(jīng)節(jié)剪碎成肉糜狀,轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞培養(yǎng)液的試管中(細(xì)胞培養(yǎng)液中含有1.0 mg/ml的膠原酶、0.5 mg/ml的胰蛋白酶及0.1 mg/ml的脫氧核糖核酸酶Ⅰ,并添加1.25 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化作用),在35 ℃環(huán)境下振蕩并培養(yǎng)25～30 min。然后用Pasteur管輕輕吹打以分散細(xì)胞,將分散后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10 ml的離心管中,置于含有10%胎牛血清及100 ng/ml的生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24 h(37 ℃下,95% O2及5% CO2環(huán)境下)。

1.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄及數(shù)據(jù)采集

1.2.1 全細(xì)胞膜片鉗記錄方法 使用EPC-10膜片鉗放大器及PULSE軟件(HEKA Electronic,Lambrecht,德國)在22～25 ℃的室溫下進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄,將分離的脊髓神經(jīng)元轉(zhuǎn)移至35 mm的培養(yǎng)皿中,在記錄電生理前將脊髓神經(jīng)元于含150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L HEPES及10 mmol/L d-葡萄糖的500 ml正常外部溶液中停留至少60 min,用NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7.4,用蔗糖溶液調(diào)節(jié)其滲透壓至330 mOsm/L。使用Sutter P-97拉拔器(Sutter Instruments,CA,美國)拉動記錄移液器,其電阻在3～6 MΩ范圍內(nèi),通過微操縱器控制電極使封接電阻達(dá)GQ后,輕施負(fù)壓使細(xì)胞破膜,調(diào)節(jié)相應(yīng)電容補(bǔ)償,即可獲得全細(xì)胞模式。在實驗全程中,細(xì)胞均鉗制在-60 mV電壓下,在電壓鉗模式下形成穩(wěn)定的全細(xì)胞配置后,通過切換到電流鉗模式獲得電流鉗記錄,采集10 kHz記錄電流,并過濾2 kHz電流,使用pCLAMP10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測及分析,選擇直徑為15～35 μm的神經(jīng)元用于記錄電生理,且本研究僅使用具有穩(wěn)定靜息膜電位(比-50 mV更負(fù))的細(xì)胞。

1.2.2 右美托咪定對ASICs介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)電流的調(diào)制作用的研究 選擇直徑在15～30 μm的大鼠脊髓神經(jīng)元采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄電流,將其隨機(jī)分為酸溶液組、右美托咪定組及右美托咪定+酸性溶液組。右美托咪定組單獨予0.1 μmol/L右美托咪定,觀察是否有電流引出。右美托咪定+酸性溶液組在實驗中加入右美托咪定處理5 min后,再加入酸性溶液,使其pH約4.5時,并再次觀察是否有電流引出。酸溶液組僅含有10 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液,且pH為4.5,觀察是否有電流引出。并在所有組別的細(xì)胞外液中加入瞬時感受器香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)阻斷劑香草素受體亞家族拮抗劑(Capsazepine,CPZ),以排除TRPV1介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)電流對實驗的干擾。

1.2.3 不同濃度右美托咪定對大鼠脊髓神經(jīng)元ASICs電流的調(diào)制效果 將pH 4.5時ASICs介導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元電流幅度作為對照組,觀察右美托咪定濃度從0.1 μmol/L逐漸增加到10 μmol/L時其作用效果。不同濃度右美托咪定量效曲線用Hill方程擬合:I/I50=[1+(C/C50)n]-1,n為Hill系數(shù),C50為半數(shù)有效時藥物濃度。

1.2.4 不同pH時右美托咪定對ASICs電流峰值幅度的影響效果 比較不同pH值(6.5,5.5,4.5)時0.1 μmol/L右美托咪定對脊髓神經(jīng)元酸敏感離子通道的抑制作用,并分析α2A受體在右美托咪定調(diào)節(jié)酸敏感離子通道中的作用。電流抑制率(%)=(對照ASICs電流幅值-藥物作用時ASIC電流幅值)/對照ASIC電流幅值×100%。

1.2.5 α2A受體與右美托咪定在調(diào)節(jié)ASICs電流時的關(guān)系 向0.1 μmol/L右美托咪定預(yù)處理過的pH為4.5的酸溶液脊髓神經(jīng)元細(xì)胞(0.5 ml)中加入α2A受體拮抗劑育亨賓,觀察ASICs電流情況,分析α2A受體在右美托咪定調(diào)節(jié)酸敏感離子通道中的作用。

1.3 藥物及試劑

本實驗中涉及的藥物:0.1 μmol/L鹽酸右美托咪定(2 ml:200 μg/支,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H20090248)、98%育亨賓(20 mg/支,成都格利普生物科技有限公司)。實驗濃度的藥物在正常外部溶液中新鮮制備,并用NaOH將其pH調(diào)至7.4。藥物出口與記錄的神經(jīng)元之間的距離約為30 μm。為了確保藥物注入細(xì)胞內(nèi)部,整個細(xì)胞通路的建立和電流測量之間至少間隔30 min。為了在功能上評估ASICs活性,采用CPZ(5 μmol/L)來阻斷細(xì)胞外溶液中的瞬時感受器香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對大鼠脊髓神經(jīng)元上ASICs介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)電流的調(diào)制作用

單獨應(yīng)用右美托咪定時未能引出電流;當(dāng)預(yù)先在實驗中加入右美托咪定處理5 min后,再次加入酸性溶液,使其pH約4.5時,右美托咪定使S型電流峰值減少(37.1 ±4.9)%;F型電流峰值減少(35.2 ±5.1)%;B型電流峰值減少(38.1 ±6.2)%(見表1)。

表1 右美托咪定對ASICs介導(dǎo)電流的抑制作用

2.2 不同濃度右美托咪定對ASICs電流的調(diào)制作用

隨著預(yù)處理右美托咪定的濃度從0.1 μmol/L增加到10 μmol/L,pH 4.5的電流峰值幅度逐漸降低(見圖1)。將不同濃度右美托咪定對ASICs介導(dǎo)電流的抑制率進(jìn)行擬合,經(jīng)擬合計算得到右美托咪定抑制ASICs介導(dǎo)電流的半數(shù)最大有效濃度為(1.18 ±0.11)μmol/L。

2.3 不同pH值的酸性環(huán)境下右美托咪定對ASICs電流峰值幅度的影響

未加入右美托咪定時,不同pH環(huán)境下的電流峰值幅度間無明顯差異(F=1.533,P>0.05);在用右美托咪定預(yù)處理(3 μmol/L,2 min)后,pH 6.5、pH 5.5及pH 4.5時所有ASICs介導(dǎo)的電流峰值振幅均較處理前降低(均P<0.05),但不同pH環(huán)境下的電流峰值幅度間無明顯差異(F=1.848,P>0.05,見表2)。

圖1 不同濃度右美托咪定對ASICs介導(dǎo)電流的抑制作用 Frgure 1 The inhibitory effect of different concentrations of dexmedetomidine on ASICs-mediated conduction current

表2 不同pH值的酸性環(huán)境下右美托咪定對ASICs電流峰值幅度的影響

2.4 α2A受體與右美托咪定調(diào)節(jié)ASICs電流的關(guān)系

經(jīng)過右美托咪定預(yù)處理的pH4.5時ASICs介導(dǎo)電流的振幅降低了(41.23 ±5.47)%,但應(yīng)用育亨賓與右美托咪定競爭阻斷α2A受體后,pH4.5時電流峰值的振幅僅僅下降了(7.03 ±2.15)%(P<0.01,見圖2),結(jié)果顯示育亨賓能阻斷右美托咪定對ASICs電流的調(diào)節(jié)作用,提示右美托咪定可能主要系通過調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元中的α2A受體,從而抑制ASICs電流。

與右美托咪定組比較，* * *P<0.001圖2 右美托咪定與育亨賓抑制ASICs介導(dǎo)電流的關(guān)系Figure 2 The function of dexmedetomidine in yohimbine inhibiting ASICs-mediated conduction current

3 討論

右美托咪定可通過激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓α2受體,從而起到交感阻滯、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛的作用。α-2受體有3個亞型(α-2A、α-2B及α-2C),右美托咪定對可與神經(jīng)系統(tǒng)中α-2A受體高度結(jié)合,從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用[9,10]。ASICs是目前已經(jīng)公認(rèn)的外周神經(jīng)傷害性受體,參與機(jī)體缺血、炎癥及酸中毒等病理過程,形成或調(diào)制機(jī)體機(jī)械感覺,除此之外,ASICs作為皮膚、肌肉等組織的疼痛感受器,在痛覺中也發(fā)揮著作用[11]。α2-ARs及ASICs都存在于脊髓神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中,且都與疼痛的調(diào)制相關(guān),二者間可能存在某種聯(lián)系,但目前α2-Ars與ASICs間的相關(guān)性研究不慎明了,故本試驗基于此,對ASICs在右美托咪定鎮(zhèn)痛中的作用機(jī)制及α2-Ars與ASICs間的關(guān)系進(jìn)行初步研究。

本實驗通過研究右美托咪定對ASICs的影響及α2-ARs與ASICs間的關(guān)系,結(jié)果顯示,右美托咪定能降低酸性環(huán)境下大鼠脊髓神經(jīng)節(jié)神經(jīng)根中由ASIC介導(dǎo)的電流幅度,在全細(xì)胞膜片鉗實驗中,在細(xì)胞外液中加入能特異性阻斷TRPV1的CPZ,右美托咪定仍能抑制電流產(chǎn)生,表明大鼠脊髓神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上的ASICs可能是右美托咪定產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的相關(guān)靶點。ASICs主要是質(zhì)子門控陽離子通道,當(dāng)細(xì)胞外pH值降至7.0以下時被激活,在pH值處于生理正常值期間,其由非質(zhì)子配體觸發(fā)[12]。該通道是酸激活反應(yīng)及酸中毒引起的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)生理變化的重要介質(zhì),ASIC1b主要存在于外周感覺神經(jīng)元中,功能性ASIC1b在外周傷害感受和疼痛中發(fā)揮作用[13,14]。在術(shù)后疼痛等某些病理性疼痛情況下,質(zhì)子釋放導(dǎo)致體內(nèi)pH值降低,呈現(xiàn)出酸性環(huán)境,且這種pH值的降低會持續(xù)數(shù)天,目前已有相關(guān)研究表面,發(fā)現(xiàn)含有ASIC3的外周通道可檢測出pH值發(fā)生變化并可導(dǎo)致術(shù)后疼痛,而術(shù)中應(yīng)用ASIC3抑制劑能有效的鎮(zhèn)痛[15,16]。且隨著右美托咪定的濃度不斷增加,其對ASICs介導(dǎo)的電流的抑制作用不斷加強(qiáng),表明右美托咪定可能系通過跨膜信號傳導(dǎo)途徑抑制電流,或通過結(jié)合ASICs從而起到變構(gòu)調(diào)節(jié)的作用。

當(dāng)向經(jīng)右美托咪定預(yù)處理過的神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入育亨賓后,右美托咪定對ASICs介導(dǎo)電流的抑制效果下降,而育亨賓為α2A受體拮抗劑,提示右美托咪定可能系通過激動α2A受體,從而抑制ASICs介導(dǎo)電流。此外,通過對不同pH值環(huán)境下右美托咪定對ASICs介導(dǎo)的電流抑制情況進(jìn)行分析顯示,不同酸性環(huán)境下,右美托咪定對ASICs的抑制效果相似,并無明顯差異。提示右美托咪定抑制了ASICs對質(zhì)子的最大反應(yīng),但質(zhì)子敏感性沒有變化。但值得一提的是,ASCIs只是痛覺感受器的一部分,即使將ASIC基因完全敲除,也不能將任何一種形式的痛覺完全去除掉[17,18]。

綜上,右美托咪定對于脊髓神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能系通過激動α2A受體從而抑制酸性環(huán)境下ASICs介導(dǎo)的電流,從而起到鎮(zhèn)痛的作用,為鎮(zhèn)痛藥的作用機(jī)制及作用靶點提供了新的研究方向。本實驗存在不足之處為:樣本容量較少,故具有一定局限性;本實驗并未研究ASICs調(diào)控的具體蛋白,故應(yīng)對其作用機(jī)制及作用靶點進(jìn)行深入研究,以便為治療提供新思路及新方向。