黃智慧 王慶敏 馬愛軍 郭曉麗

(1 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省海洋漁業(yè)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071； 2 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071)

海洋纖毛蟲在微生物食物環(huán)中占據(jù)重要而又特殊的地位，也是引發(fā)赤潮和養(yǎng)殖動(dòng)物病害的常見種，從而成為人們?nèi)找骊P(guān)注的對(duì)象。盾纖毛蟲隸屬于纖毛門(Ciliophora)、寡膜綱(Oligohymenophorea)、盾纖目(Scuticociliatida)[1]。該類纖毛蟲通常自由生活在海水中，但在一些情況下，如魚體受傷、環(huán)境惡化等，可引起海水養(yǎng)殖動(dòng)物感染，纖毛蟲表現(xiàn)為寄生性，以宿主細(xì)胞或組織為食，并在其組織中生長(zhǎng)、繁殖，導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物大量死亡[2]。目前已有報(bào)道，海洋尾絲蟲(Uronemamarinum)、水滴偽康纖蟲(Pseudocohnilembuspersalinus)和貪食邁阿密蟲(Miamiensisavidus)等能夠引起大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[3-4]、鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[5]、比目魚(Paralichthysolivaceus)[6]、海龍(Phyllopteryxtaeniolatus)[7]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[8]、藍(lán)鰭金槍魚(Thunnusmaccoyii)[9]等海洋魚類發(fā)病[10]。近年來，有關(guān)海洋纖毛蟲分離培養(yǎng)的研究?jī)H限于不同培養(yǎng)液對(duì)其種群增長(zhǎng)的影響，而對(duì)寄生性的纖毛蟲在不同培養(yǎng)液中的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道較少。本研究從山東煙臺(tái)地區(qū)患病大菱鲆的體表分離出貪食邁阿密蟲，挑取單個(gè)蟲體進(jìn)行純化培養(yǎng)，并篩選了4種盾纖毛蟲常用的體外培養(yǎng)液，研究了不同培養(yǎng)基對(duì)其種群生長(zhǎng)及復(fù)壯毒力的影響。

1 材料和方法

1.1 盾纖毛蟲的分離與純化培養(yǎng)

2018年10月，從山東省煙臺(tái)市某大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng)收集被盾纖毛蟲感染的大菱鲆(體長(zhǎng)約15 cm)，刮取病魚體表的潰爛組織，鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量的盾纖類纖毛蟲，經(jīng)鑒定為貪食邁阿密蟲(Miamiensisavidus)。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蟲體分離。步驟為：剪取魚體部分病灶組織，剪碎，加入50 mL離心管中，置于18～20 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～36 h。吸取纖毛蟲培養(yǎng)液，滴入裝有濾紙的漏斗進(jìn)行過濾，反向滴洗濾紙，獲得10 mL蟲體收集液，經(jīng)在顯微鏡下計(jì)數(shù)，其密度大于3×102個(gè)/mL。

1.2 4種培養(yǎng)液的制備

1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)液(DH)

取-80 ℃凍存的DH5α大腸桿菌100 μL作為細(xì)菌母液，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行如下操作：在5個(gè)50 mL離心管中分別加入LB培養(yǎng)液，每管40 mL；用移液槍取25 μL細(xì)菌母液分至5個(gè)離心管中，將離心管放入37 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床中搖菌24 h。然后將在恒溫?fù)u床中的LB液體培養(yǎng)基取出，放入離心機(jī)，以7 000 g離心10 min。于超凈工作臺(tái)中傾倒上清，加滅菌海水至10 mL，重懸大腸桿菌沉淀，再加海水至40 mL，放入離心機(jī)，以7 000 g離心10 min，反復(fù)沖洗2次。重懸大腸桿菌沉淀，再加海水至30 mL。于4 ℃冷藏備用。

1.2.2 牛肉浸膏培養(yǎng)液(BEV)

分別取牛肉浸膏10 g溶于100 mL人工海水中，配制成100 g/L牛肉浸膏培養(yǎng)液，靜置24 h后備用。

1.2.3 米粒培養(yǎng)液(RV)

每100 mL滅菌人工海水中加入30粒消毒米粒，即配制成米粒培養(yǎng)液(RV)。

1.2.4 改良L-15培養(yǎng)液(鹽度為10)(L-15)

配制640 mL的L-15(Leibovitz)培養(yǎng)液。分別添加腺苷(adenosine)、胞啶(cytidine)、尿苷(uridine)各90 mg，鳥苷(guanosine)150 mg，以及葡萄糖(glucose)5 g。添加250 mL脂質(zhì)液(從干粉蛋黃中溶解1.6 mg/mL卵磷脂，以純凈水溶解0.8 mg/mL Tween 80，制備脂質(zhì)液)。通過0.22 μm濾膜過濾。在無菌條件下，添加100 mL的10%胎牛血清FBS，添加前FBS應(yīng)在56 ℃下水浴30 min滅活。最后添加10 mL 100×抗真菌劑(antibiotic antimycotic solution)。調(diào)節(jié)pH到7.2，再用0.22 μm濾膜過濾。

1.3 不同培養(yǎng)液對(duì)貪食邁阿密蟲種群生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，每孔加入2 mL培養(yǎng)液，參考張立坤等[11]的步驟進(jìn)行接種：將處于種群生長(zhǎng)平衡期的蟲體分別接種至4種培養(yǎng)液中，在23 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每種培養(yǎng)液設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)組。定時(shí)計(jì)數(shù)，取3次樣品的平均值。按以下公式[12]計(jì)算種群自然增長(zhǎng)率。

lnNt=lnN0+rt，

(1)

式(1)中，Nt為經(jīng)過t時(shí)長(zhǎng)后的種群密度(個(gè)/mL)；N0為種群初始密度(N0=1×102個(gè)/mL)；以時(shí)長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，因變量是纖毛蟲密度的自然對(duì)數(shù)，其斜率即種群自然增長(zhǎng)率r。

將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)代入以上公式，可求出種群自然增長(zhǎng)率r。

1.4 不同培養(yǎng)液對(duì)大菱鲆貪食邁阿密蟲復(fù)壯毒力的影響

選取健康大菱鲆幼魚[體質(zhì)量為(30.0±7.2)g]共計(jì)120尾進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。將幼魚暫養(yǎng)7 d，饑餓3 d后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)期間正常投喂。試驗(yàn)水溫為(16±1)℃，鹽度為30，用氧氣泵連續(xù)充氧，水體溶解氧保持在7.3 mg/L以上。通過腹腔注射貪食邁阿密蟲，即注射不同培養(yǎng)液濃縮獲得的0.1 mL貪食邁阿密蟲PBS懸浮液(蟲的濃度為1×105個(gè)/mL)，參照Paramá等[13]的注射步驟進(jìn)行操作。試驗(yàn)時(shí)間共3周，其間記錄試驗(yàn)魚首次出現(xiàn)感染的時(shí)間、死亡時(shí)間，統(tǒng)計(jì)死亡率等數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。用Duncan’s檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析和多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，設(shè)P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)液對(duì)貪食邁阿密蟲種群增長(zhǎng)曲線分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，貪食邁阿密蟲在4種培養(yǎng)液中均可以生長(zhǎng)，且在種群增長(zhǎng)過程中均存在停滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期4個(gè)時(shí)期，其生長(zhǎng)情況見圖1所示。其中，BEV和L-15組較先達(dá)到密度高峰，DH和RV組則遲24 h才達(dá)到密度高峰。L-15組的種群密度最高，且穩(wěn)定期較長(zhǎng)，衰退期較晚；RV組次之。由圖1可看出，各組種群增長(zhǎng)曲線之間在不同時(shí)間點(diǎn)存在不同程度的差異。

圖1 貪食邁阿密蟲在4種培養(yǎng)液中的種群增長(zhǎng)曲線

2.2 不同培養(yǎng)液對(duì)貪食邁阿密蟲的復(fù)壯毒力分析

在不同培養(yǎng)液條件下貪食邁阿密蟲感染大菱鲆的毒力分析見表1。結(jié)果顯示，在DH與RV兩種培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的貪食邁阿密蟲毒力較弱，其致死率分別為43.80%和49.30%，而BEV和L-15組毒力顯著高于其他2組(P<0.05)，其中L-15致死率最高，達(dá)85.10%。從感染時(shí)間來看，BEV和L-15組感染較早。4種培養(yǎng)基的首末尾感染歷時(shí)沒有顯著差異(P>0.05)。L-15首尾死亡時(shí)間最早，僅(6.00±0.66)d即死亡，其次為BEV、RV、DH，而4種培養(yǎng)基的首末尾死亡歷時(shí)沒有顯著差異(P>0.05)。因此可以判斷，L-15培養(yǎng)液最符合貪食邁阿密蟲的寄生環(huán)境，BEV次之。

表1 不同培養(yǎng)液下貪食邁阿密蟲感染大菱鲆的情況比較

3 討論

貪食邁阿密蟲屬于兼性或機(jī)會(huì)寄生種盾纖毛蟲，通常情況下營(yíng)自由生活，在特定條件下可在養(yǎng)殖魚類體內(nèi)外營(yíng)寄生生活，如在養(yǎng)殖魚類傷殘，養(yǎng)殖環(huán)境水溫、酸堿度等發(fā)生較大變化，魚體免疫力降低等情況下，纖毛蟲會(huì)直接危害魚體[14]。貪食邁阿密蟲對(duì)環(huán)境變化有很強(qiáng)的適應(yīng)力，且有較高的種群自然增長(zhǎng)率，這是纖毛蟲病傳染迅速的原因。本研究從養(yǎng)殖場(chǎng)患病大菱鲆體表分離出盾纖毛蟲，經(jīng)初步鑒定為貪食邁阿密蟲，之后對(duì)其進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，研究不同培養(yǎng)液對(duì)其毒力的影響。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)液篩選試驗(yàn)中，改良L-15組貪食邁阿密蟲種群密度最高，且穩(wěn)定期較長(zhǎng)，衰退期較晚，因此判斷該培養(yǎng)液更適合于盾纖毛蟲的體外培養(yǎng)。本研究結(jié)果與高延奇等[10]的研究結(jié)果相似。推測(cè)其原因是L-15中含有無機(jī)鹽、氨基酸、維生素，而且氨基酸含量較高，高水平的氨基酸對(duì)體外培養(yǎng)纖毛蟲的生存和繁殖很重要。復(fù)壯后的毒力分析發(fā)現(xiàn)，L-15組培養(yǎng)的纖毛蟲死亡率最高，達(dá)到85.10%，而L-15組的感染時(shí)間較早，首尾魚死亡時(shí)間也最早，表明改良L-15組蟲體毒力更強(qiáng)。筆者推測(cè)，改良后的L-15中含有胎牛血清，這樣的環(huán)境條件模擬了盾纖毛蟲的寄生環(huán)境。這一結(jié)果與Paramá等[13]的研究結(jié)果相似。因此可以判斷，改良L-15培養(yǎng)液最符合貪食邁阿密蟲的寄生環(huán)境，BEV次之。

纖毛蟲病是我國(guó)大菱鲆、牙鲆養(yǎng)殖中普遍發(fā)生的1種疾病，而目前我國(guó)對(duì)海洋中有關(guān)致病性纖毛蟲原生動(dòng)物個(gè)體及其實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)的研究較薄弱，仍無特效防治方法[11]。在實(shí)驗(yàn)室研究中，保持寄生蟲的種群自然增長(zhǎng)率及寄生毒力是免疫診斷等試驗(yàn)順利開展的前提，也是試驗(yàn)數(shù)據(jù)科學(xué)準(zhǔn)確的重要保障。本研究探討了實(shí)驗(yàn)室常用的纖毛蟲培養(yǎng)液對(duì)纖毛蟲的生長(zhǎng)及毒力的影響，為開展新型殺蟲物質(zhì)研究和開發(fā)增強(qiáng)魚體自身免疫力的抗蟲藥物提供了安全、高效的蟲體培養(yǎng)方案。