王新宇 王欣欣 位正鵬 陳奕名 王鵬 李銀平 喬樂克 劉瑞志

(1 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003； 2 中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012； 3 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042；4 海洋功能食品國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東榮成 264309)

舟山漁場位于杭州灣以東、長江口東南的浙江東北部，面積約5.3萬km2，是中國最大的漁場。舟山國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)基地的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019年當(dāng)?shù)亟饦岕~產(chǎn)量達(dá)到6.2萬t，主要加工為生魚片和各類罐藏食品[1]。蒸煮是金槍魚各類罐藏食品加工過程的重要環(huán)節(jié)。據(jù)統(tǒng)計，每加工1.0 t產(chǎn)品，會產(chǎn)生約1.5 t蒸煮液[2]。蒸煮液中含有較高濃度的氮、磷，但由于加工技術(shù)限制，這些蒸煮液往往未經(jīng)處理便排放入海[3]。隨著國家對工業(yè)生產(chǎn)環(huán)保力度的加大以及舟山漁場振興計劃的實施，研究蒸煮液的處理與再利用顯得尤為重要。

目前對金槍魚加工廢棄物的研究主要集中在對下腳料的再利用方面，如從金槍魚內(nèi)臟中提取魚油[4-5]、水解金槍魚下腳料(魚頭、魚尾、內(nèi)臟、魚皮、魚鰭)制備魚蛋白有機(jī)液肥原料[6]等，對于蒸煮液的研究報道較少。何鍵東等[7]研究發(fā)現(xiàn)，金槍魚蒸煮液中富含油脂，尤其多不飽和脂肪酸含量較高。其中，DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)是ω-3長鏈多不飽和脂肪酸α-亞麻酸的代謝產(chǎn)物[8]，對人體的智力、生長發(fā)育和心腦血管都十分有益[9-10]，而且人類無法自身合成DHA和EPA，必須從食物中攝取。此外，含有高油脂的廢水產(chǎn)生的污泥易造成脫水困難，不利于污泥的綜合利用，并會造成下游處置難題。因此，回收蒸煮液中的油脂不僅可以延長金槍魚加工產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)加工企業(yè)的發(fā)展和漁業(yè)資源的可持續(xù)利用，還可以降低金槍魚加工企業(yè)的廢水預(yù)處理成本，有利于環(huán)境保護(hù)。

提取魚油的方法目前主要有復(fù)合蛋白酶水解法、傳統(tǒng)淡堿水解法、超臨界流體萃取法、蒸煮法以及有機(jī)溶劑法[11]。使用乙醇從草魚內(nèi)臟和大黃魚魚卵中提取魚油的試驗證實，乙醇作為萃取溶劑具有易回收、無污染、與油脂分離工藝簡單、食品安全風(fēng)險較低等優(yōu)點[12-13]。此外，研究表明，超聲波技術(shù)可以縮短魚油提取時間，減少溶劑用量，提高提取率，是提取蒸煮液魚油的理想輔助手段[14]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，向蒸煮液中加入一定體積的無水乙醇后可以實現(xiàn)油脂與蛋白的分離。為了能更高效地采用乙醇萃取法提取蒸煮液中的魚油，本試驗利用超聲輔助乙醇提取金槍魚蒸煮液魚油，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，并對魚油進(jìn)行品質(zhì)分析(理化指標(biāo)、脂肪酸組成、抗氧化活性)，以期為金槍魚蒸煮液魚油功能食品的開發(fā)和進(jìn)一步綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

金槍魚蒸煮液來自浙江企潤食品有限公司。14種脂肪酸甲酯混標(biāo)來自美國Sigma公司。無水乙醇、石油醚、碘化鉀、乙酰丙酮、異丙醇、環(huán)己烷、三氯甲烷、重鉻酸鉀、綠原酸、維生素E、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基等試劑均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

AR224CN電子分析天平：奧豪斯儀器(上海)有限公司；超聲波清洗機(jī)：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；精密增力電動攪拌器：常州金壇良友儀器有限公司；TD5A-WS低速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；7890A型氣相色譜儀：美國Agilent公司；M7-80EI型質(zhì)譜儀：北京普析通用儀器有限公司；UV-6000PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒸煮液污染物成分測定

采用杜伊等[15]的方法對蒸煮液中的化學(xué)需氧量、總氮、總磷、氨氮進(jìn)行測定。

1.3.2 蒸煮液魚油提取工藝

取適量蒸煮液原料，加入一定體積無水乙醇，然后置于恒溫水浴中，并不斷攪拌。反應(yīng)結(jié)束后離心、過濾、除去殘渣，收集脂類層溶液，即得到粗魚油。采用單因素試驗考察液料比、溫度、時長、超聲功率對魚油提取率的影響，然后用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化。按以下公式計算提取率(%)。

提取率=提取的魚油質(zhì)量/原料中粗脂肪質(zhì)量×100

(1)

1.3.3 魚油提取單因素試驗

分別以液料比(1、1.5、2、2.5)、溫度(25、35、45、55 ℃)、提取時長(20、30、40、50、60 min)、功率(48、96、144、192、240 W)為單因素，考察各因素對蒸煮液魚油提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計方法，以超聲溫度、超聲時間、超聲功率為響應(yīng)變量，并以-1、0、1分別代表變量的水平值，以蒸煮液魚油提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析進(jìn)行超聲條件的優(yōu)化。

1.3.5 魚油理化指標(biāo)測定方法

將提取得到的粗魚油多次水洗，根據(jù)相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行理化指標(biāo)測定。水分及揮發(fā)物：《水分及揮發(fā)物的測定》(GB 5009.236—2016)；不溶性雜質(zhì)：《不溶性雜質(zhì)含量的測定》(GB/T 15688—2008)；酸價：《食品中酸價的測定》(GB 5009.229—2016)；鉛：《食品中鉛的測定》(GB 5009.12—2017)；鉻：《食品中鉻的測定》(GB 5009.123—2014)；鎘：《食品中鎘的測定》(GB 5009.15—2014)；無機(jī)砷：《食品中總砷及無機(jī)砷的測定》(GB 5009.11—2014)；甲基汞：《食品中總汞及有機(jī)汞的測定》(GB 5009.17—2014)；多氯聯(lián)苯：《食品中指示性多氯聯(lián)苯含量的測定》(GB 5009.190—2014)。

1.3.6 脂肪酸組成分析

試樣前處理：稱取均勻試樣適量，加入2 mL 2%氫氧化鈉-甲醇溶液，在85 ℃水浴鍋中水浴30 min，再加入3 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，85 ℃水浴30 min。水浴后，待溫度降至室溫，在離心管中加入1 mL正己烷，振蕩萃取2 min后，靜置1 h，等待分層。取上層清液100 μL，用正己烷定容至1 mL。用0.45 μm濾膜過膜后上機(jī)測試。

色譜條件：HP-88(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，載氣流速為0.5 mL/min。進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度250 ℃。升溫程序為：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持30 min。

1.3.7 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率測定方法方便、快速，被廣泛應(yīng)用于抗氧化能力評價[16-17]。本試驗參照文獻(xiàn)[18]方法并作適當(dāng)修改。試驗組取1.0 mL樣品與1.0 mL 200 μmol/L的DPPH-無水乙醇溶液混勻，室溫避光放置30 min?？瞻捉M以1.0 mL無水乙醇代替DPPH溶液，其余處理方法相同。對照組以1.0 mL無水乙醇代替樣品，其余處理方法相同。于517 nm波長處測定各組的吸光度。

DPPH自由基清除率(%)=A0-[A0-(Ai0)]/A0×100

(2)

式(2)中，A0為對照組吸光度，Ai為樣品組吸光度，Ai0為空白組吸光度。

1.4 統(tǒng)計與分析

利用Origin 8.5軟件和Design Expert 8數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗的平均值。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，設(shè)顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 蒸煮液污染物分析

對蒸煮液樣品進(jìn)行污染物成分測定，結(jié)果見圖1。雖然在蒸煮過程中的用水量僅占整個加工過程的3%左右，但所產(chǎn)生的化學(xué)需氧量、總氮、氨氮、總磷占比分別達(dá)52%、37%、28%、13%。

圖1 蒸煮液主要污染物含量

2.2 魚油提取單因素試驗

2.2.1 液料比對魚油提取率的影響

當(dāng)溫度為35 ℃，提取時長為30 min，超聲功率為144 W時，不同液料比對魚油提取率的影響見圖2。當(dāng)液料比為1.5時，魚油提取率為69.92%，繼續(xù)增加液料比對提取率沒有顯著影響?？紤]到乙醇用量和蒸餾分離成本，選擇1.5為最佳提取率。

注：數(shù)據(jù)標(biāo)注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 溫度對魚油提取率的影響

當(dāng)液料比為1.5，提取時長為30 min，超聲功率為144 W時，不同提取溫度下魚油的提取率見圖3。當(dāng)溫度較低時，魚油提取率較低，當(dāng)溫度升高后，乙醇對油脂的溶解度增大，魚油提取率也隨之上升。在溫度為35 ℃時，魚油提取率為71.55%，但溫度繼續(xù)升高，魚油提取率的增幅下降。考慮到工業(yè)應(yīng)用及能耗問題，選取35 ℃為作蒸煮液魚油的提取溫度。

注：數(shù)據(jù)標(biāo)注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2.3 提取時長對蒸煮液魚油提取率的影響

當(dāng)液料比為1.5，溫度為35 ℃，超聲功率為144 W時，不同提取時長對魚油提取率的影響見圖4。當(dāng)提取時長為40 min時，魚油的提取率為77.54%，之后延長提取時間，魚油提取率的變化較小。

注：數(shù)據(jù)標(biāo)注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2.4 超聲功率對蒸煮液魚油提取率的影響

當(dāng)液料比為1.5，溫度為35 ℃，提取時長為40 min時，不同超聲提取功率對魚油提取率的影響見圖5。當(dāng)提取功率為144 W時，提取率達(dá)到81.80%，之后功率繼續(xù)增加，提取率增幅降低。

注：數(shù)據(jù)標(biāo)注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗

結(jié)合單因素試驗，選擇時間、溫度、超聲功率三因素三水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定蒸煮液魚油提取過程中超聲波處理的最佳工藝條件。試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面方案設(shè)計和試驗結(jié)果

擬合得魚油提取率(Y)與溫度(A)、時長(B)和超聲功率(C)之間的二次回歸方程模型為：Y=+88.56+3.02A+6.51B+7.07C-5.68AB-3.78AC-2.79BC-12.87A2-2.96B2-11.34C2

方程的決定系數(shù)R2=0.921 8，說明該回歸方程的擬合度較好，可通過此方程對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果見表2。

表2 回歸分析結(jié)果

由表2可見，模型差異極顯著(P<0.01)，失擬項P=0.655 0，差異不顯著，說明該模型擬合度良好，有一定可靠性，證明采用響應(yīng)面法預(yù)測金槍魚蒸煮液魚油的提取率可行。F值與響應(yīng)值的影響成正比，F(xiàn)值越大，對響應(yīng)值的影響越大[19-20]。各因素對魚油提取率的影響順序為C(超聲功率)>B(時間)>A(溫度)。其中，模型的極顯著因子項有C、A2和C2(P<0.01)，顯著的因子項為B(P<0.05)。

2.3.2 交互作用分析

各因素交互作用對魚油提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖6。由圖6可見，魚油提取率隨著時長增加而增大，隨著溫度和功率的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。對比圖6-a、c、e，各因素對響應(yīng)面的陡峭程度影響由大到小依次為：功率>溫度>時長。這與方差分析結(jié)果相同。從圖6-b可知，時長與溫度的立體投影-等高線為橢圓形，因素的交互作用影響顯著；溫度與功率的立體投影-等高線為圓形(圖6-d)，交互作用不顯著；功率與時長的立體投影-等高線為橢圓形(圖6-f)，交互作用顯著，均與方差分析結(jié)果一致。結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計較好地反映了溫度、時長、功率對魚油提取率的影響。

2.3.3 最佳工藝條件的預(yù)測與驗證

由Design Expert 8.0軟件預(yù)測得出超聲輔助無水乙醇提取蒸煮液魚油的最優(yōu)工藝條件為：提取時長60 min，提取溫度34.33 ℃，超聲功率154 W。最優(yōu)條件下的魚油提取率預(yù)測值為92.74 %。考慮到實際操作的可行性，將以上工藝條件修正為：提取時長60 min，提取溫度34 ℃，超聲功率154 W。在修正條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，得到魚油平均提取率為(91.32±0.34)%，與理論預(yù)測值相符，說明該優(yōu)化結(jié)果可靠，具有實際應(yīng)用價值。

2.4 理化指標(biāo)鑒定

由表3可知，酸價符合精制魚油二級標(biāo)準(zhǔn)；碘價、過氧化值符合精制魚油一級標(biāo)準(zhǔn)，說明超聲輔助乙醇法提取的魚油具有較好的品質(zhì)。

表3 魚油理化性質(zhì)

2.5 污染物含量分析

對本方法制得的魚油進(jìn)行了相關(guān)重金屬含量的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘的含量要明顯高于鉛、鉻、無機(jī)砷、甲基汞，但均低于《食品中污染物限量》(GB 2762—2017)中的限量，同時多氯聯(lián)苯含量也遠(yuǎn)低于國家的限量標(biāo)準(zhǔn)(見表4)。

表4 魚油中污染物含量 單位：mg/kg

2.6 脂肪酸組成分析

由表5可知，用本方法提取的蒸煮液魚油的脂肪酸組成不僅富含ω-3多不飽和脂肪酸——DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)，同時含有較高的單不飽和脂肪酸(棕櫚油酸和油酸)。

表5 魚油脂肪酸組成

2.7 抗氧化活性分析

本試驗以DPPH自由基清除能力來表征魚油的抗氧化活性。由圖7可見，隨著魚油質(zhì)量濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也在增加。當(dāng)魚油質(zhì)量濃度為30 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為(92.36±1.55)%。分析結(jié)果顯示，魚油對DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)為(6.13±0.53)mg/mL。

圖7 金槍魚蒸煮液魚油的DPPH自由基清除率

本文選取維生素E(VE)和酚類抗氧化劑綠原酸，研究其對魚油抗氧化的協(xié)同作用。由表6可見，當(dāng)魚油質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，不同質(zhì)量濃度的VE、綠原酸與魚油組合對DPPH自由基的清除率有協(xié)同作用，其中，2 mg/mL魚油與2 μg/mL VE的組合協(xié)同作用最強(qiáng)，協(xié)同值為13.51%。VE對魚油抗氧化的協(xié)同作用強(qiáng)于綠原酸。當(dāng)魚油質(zhì)量濃度為4 mg/mL和6 mg/mL時，魚油與VE或綠原酸組合均對DPPH自由基清除率表現(xiàn)為拮抗作用。

表6 魚油與維生素E、綠原酸的組合對DPPH自由基的清除能力

3 討論

金槍魚經(jīng)過原料預(yù)處理、蒸煮、去骨修整、罐裝、殺菌、冷卻等步驟后，可制成金槍魚罐頭，其中蒸煮是生產(chǎn)加工過程中的主要環(huán)節(jié)[21]。污染物分析試驗結(jié)果顯示，蒸煮液中含有較高的化學(xué)需氧量、氨氮、總磷、總氮，因此，對蒸煮液進(jìn)行處理與再利用不僅能夠有效減少環(huán)境污染，還可以提高金槍魚生產(chǎn)加工的附加值，帶來經(jīng)濟(jì)效益。本試驗采用超聲波輔助乙醇法提取魚油，通過響應(yīng)面法對于提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)液料比為1.5時，蒸煮液中的大部分魚油已被提取，此時魚油與乙醇溶液達(dá)到平衡狀態(tài)[13]；提取溫度的升高會增加溶劑分子和油脂分子的動能，促進(jìn)擴(kuò)散運(yùn)動的進(jìn)行，使油脂提取率增加[22]；但當(dāng)提取達(dá)到一定時長后，提取過程變?yōu)閯討B(tài)平衡，提取率不再增加[23]；超聲波輔助可以縮短提取時長，提高提取率，因為隨著超聲波功率的增大，油脂易與非脂成分如蛋白質(zhì)分離而提高提取率[24]，但是當(dāng)超聲功率過大時，超聲波的傳播衰減將增大，導(dǎo)致提取率增速減慢[25]。本試驗中，響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計較好地反映了溫度、時長、超聲功率對魚油提取率的影響，在修正條件下的3次平行試驗也進(jìn)一步驗證了該優(yōu)化結(jié)果的可靠性和可行性。

理化指標(biāo)鑒定結(jié)果顯示，超聲輔助乙醇法提取的魚油具有較好的品質(zhì)，其酸價、碘價、過氧化值與何鍵東等[7]經(jīng)脫膠、脫酸、脫色及脫臭所得的結(jié)果相近。其中酸價、過氧化值與郭休玉等[12]等采用乙醇提取的草魚內(nèi)臟魚油結(jié)果相近，明顯低于王倩倩等[26]等采用酶法制得的羅非魚魚油。

海水污染中的重金屬如鎘、鉻、鉛、砷污染已經(jīng)成為全世界的問題，這些金屬易在海產(chǎn)品生物體內(nèi)富集[27]。張乾通[28]研究發(fā)現(xiàn)，舟山漁場鉛、鎘、甲基汞的超標(biāo)率分別為3.90%、11.35%、2.84%。經(jīng)檢測，本試驗方法制得的魚油，其鉛、鉻、鎘、無機(jī)砷、甲基汞、多氯聯(lián)苯均在國家限量范圍內(nèi)。

金槍魚的DHA含量是魚類中最高的[29]。本試驗方法提取的魚油，其DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)36.18%，明顯高于三文魚[24]、虹鱒[25]、羅非魚[26]、魷魚[30]魚油中DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，也高于何鍵東等[7]采用胰蛋白酶酶解金槍魚蒸煮液的方法提取并經(jīng)過脫膠、脫酸、脫色、脫臭制得的精制魚油。這說明超聲輔助乙醇法提取的魚油有利于開發(fā)功能性魚油產(chǎn)品。目前關(guān)于金槍魚魚油抗氧化活性的報道還很少，本文從蒸煮液中提取出的魚油具有較好的抗氧化活性，其IC50值與鮐魚魚頭油(5.95 mg/mL)接近[31]。

目前協(xié)同作用已成為抗氧化劑領(lǐng)域中的研究熱點[32]，金槍魚蒸煮液魚油的協(xié)同抗氧化效果和藍(lán)圓鲹抗氧化肽與其他抗氧化劑[33]以及蝦青素與β-胡蘿卜素[34]相似。這可能是因為魚油中多不飽和脂肪酸含量較高，當(dāng)與其他抗氧化劑混合時，隨著濃度的增大，一些未知的潛在的相互作用被放大而導(dǎo)致復(fù)合抗氧化能力降低，表現(xiàn)出負(fù)協(xié)同作用[35]。

4 結(jié)論

本研究對超聲輔助乙醇提取金槍魚蒸煮液魚油工藝進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果，最優(yōu)工藝條件為：提取溫度34 ℃，提取時長60 min，超聲功率154 W。在該工藝條件下魚油的提取率為91.32%。該工藝提取的魚油，其酸價、碘價、過氧化值分別為1.86 mg/g、145.8 g/100 g、2.06 mmol/kg，可達(dá)到精制魚油標(biāo)準(zhǔn)；鉛、鉻、鎘、無機(jī)砷、甲基汞、多氯聯(lián)苯標(biāo)的含量分別為<0.02、<0.01、0.07、<0.03、<0.008、<0.000 5 mg/kg，均低于《食品中污染物限量》(GB 2762—2017)中的限量；提取的魚油富含ω-3多不飽和脂肪酸，DHA和EPA總量達(dá)40.49%，其對DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為6.13 mg/mL，且低濃度魚油可與VE或綠原酸組合產(chǎn)生協(xié)同抗氧化作用，但高濃度魚油與VE或綠原酸的組合對DPPH自由基的清除率均表現(xiàn)為拮抗作用。