朱為民，沈 秀，徐宇嘯

(浙江省臺(tái)州醫(yī)院/臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))恩澤醫(yī)院 1.急診科； 2.急診外科；3.病理科，浙江 臺(tái)州 318000)

心肌急性缺血發(fā)生后，應(yīng)對(duì)組織灌注進(jìn)行及時(shí)恢復(fù)治療，但再灌注本身能進(jìn)一步加劇心肌損傷的受損程度，即引發(fā)心肌缺血再灌注(I/R)損傷。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道微小RNA(miRNA)作為一類約20個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫及心血管等疾病中均存在一定的調(diào)控作用。既往報(bào)道m(xù)iR-204參與了癌癥、眼科及高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展，而miR-204對(duì)I/R損傷機(jī)制的研究在國內(nèi)尚未報(bào)道。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，2是miR-204其中的一個(gè)靶基因，有研究發(fā)現(xiàn)2可通過JAK-STAT通路對(duì)IGF-1的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而加劇糖尿病I/R損傷。鑒于此，本研究擬在建立I/R損傷模型基礎(chǔ)上，探討miR-204是否通過抑制SOCS2表達(dá)對(duì)小鼠I/R損傷作用機(jī)制產(chǎn)生影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只C57BL/6小鼠購自南京君科生物工程有限公司，每只體質(zhì)量20～30 g，10～12 周齡。自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)喂養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)環(huán)境：清潔級(jí)，濕度維持在55%～60%，室溫22℃～25℃，正常晝夜節(jié)律。先選用10只小鼠，構(gòu)建心肌缺血再灌注模型并進(jìn)行鑒定，之后隨機(jī)選擇30只小鼠按鑒定成功的建模方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)審核，受到動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)的監(jiān)督。

1.2 I/R小鼠模型構(gòu)建建模前，10只小鼠禁食8 h，采用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠；取仰臥位，消毒后切開小鼠頸前區(qū)皮膚，分離組織、肌肉，充分暴露氣管；氣管插管，連接呼吸機(jī)；在小鼠第5肋間隙表皮左側(cè)做縱向切口，約2 cm，接著逐層對(duì)胸大、小肌進(jìn)行分離，刺穿暴露的第四肋間隙，向左側(cè)穿破縱膈，將心臟擠出。在左心耳下緣 0.5 cm處，通過 6-0 縫合線對(duì)左冠狀動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎。建模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)缺血時(shí)局部心肌組織蒼白，心電圖監(jiān)測(cè)提示ST段抬高，則表明結(jié)扎成功；半小時(shí)后，將活結(jié)松開且重新計(jì)時(shí)，若5 min內(nèi)ST 段恢復(fù)或與之前波形存在明顯區(qū)別，則再灌注成功。之后將心臟置于胸腔，排氣胸，縫合皮膚。假手術(shù)組(Sham，10只)采用同樣的開胸方式，但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 余30只小鼠分為I/R組、mimics-NC組、miR-204 mimics組，每組10只。mimics-NC組、miR-204 mimics組小鼠在建模前48 h將100 uL mimics-NC、miR-204 mimics預(yù)先與Lipofectamine 2000混合分別注射至小鼠心肌內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 主要試劑 戊巴比妥鈉溶液購自Sigma公司；Lipofectamine 2000及RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；mimics-NC及miR-204 mimics均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，ELISA試劑盒購自貝克曼庫爾特公司；Masson染色試劑盒購自Service Biological Technology公司；PrimeScript RT試劑盒及SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒購自寶生物工程有限公司；ABI PRISM7300系統(tǒng)購自美國ABI 公司；BCA試劑盒購自AmyJet Scientific公司；SOCS2一抗購自Cell Signaling Technology公司，二抗購自Abcam公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自Promega公司。引物序列：miR-204，上游：5’ GCCAGATCTGGAAGAAGATGTGGTGGGTTAGT 3’，下游：5’ GGCGAATTCACAGTTGCCTACAGTATTCA 3’；U6，上游5’CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3’，下游5’ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC3’；SOCS2 ，上游：5’ AGCAGTTTGACAGCGTGGTT 3’，下游：5’ CAGGTAAAGGTGAACAGTCCC 3’；β-actin ，上游：5’ CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3’，下游：5’ TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3’。

1.5 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.5.1 血清因子 取小鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，3 000 r/min離心，取上清，參照ELISA試劑盒(貝克曼庫爾特公司，加州，美國)說明書操作步驟測(cè)定腦鈉肽(BNP)、心肌肌鈣蛋白( CTn-I)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、白細(xì)胞介素-1β( IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)，采用日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。對(duì)比各組心肌損傷因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)及炎癥因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)水平。

1.5.2 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,立即取出心臟，沖洗殘血至心室腔無血液流出，對(duì)去除心室及心房的心臟組織進(jìn)行沖洗，一部分心肌組織在4%多聚甲醛溶液中固定，一部分組織保存于-80℃。

取置于4%多聚甲醛中固定24 h后的心臟組織，截取心肌組織，做0.3 cm厚的切片，將左室分為6片。常規(guī)石蠟包埋切片,做6 μm厚的薄片，置于45℃恒溫箱中烘干。蘇木精染色3 min，于1%的鹽酸乙醇中2 s，1%氨水返藍(lán)，伊紅染色3 min，脫水至透明，中性樹脂封片，干燥72 h，于光學(xué)顯微鏡下對(duì)心肌組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。

取置于4%多聚甲醛中的心肌組織，常規(guī)切片，脫蠟。在不同酒精梯度中進(jìn)行浸泡，Masson染色，觀察心肌組織纖維化程度，光鏡下觀察，每張切片選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察拍照。

1.5.3 miR-204、2 mRNA測(cè)定 通過qRT-PCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織中miR-204、2 mRNA的表達(dá)，通過RNA提取試劑盒提取心肌組織中總RNA。通過PrimeScript RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μL。通過SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒及ABI PRISM7300系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件：95℃ 10 min(95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)循環(huán)40次。數(shù)據(jù)予以2法計(jì)算目的基因的表達(dá)。其中U6是miR-204的擴(kuò)增內(nèi)參，β-actin是2 、TNF-a、IL-1β、IL-6的擴(kuò)增內(nèi)參。

1.5.4 SOCS2 蛋白測(cè)定 采用Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定心肌組織中SOCS2 蛋白表達(dá)水平。取心肌組織，經(jīng)RIPA裂解液裂解，研磨后離心取上清，通過BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將提取的總蛋白與上樣緩沖液混合，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離蛋白，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，室溫下磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入相應(yīng)的羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育l h，洗滌，化學(xué)發(fā)光試劑顯影，蛋白印記圖像用ImageJ2x軟件分析。

1.5.5 熒光素酶活性檢測(cè) 采用生物信息學(xué)軟件http://starbase.sysu.edu.cn/預(yù)測(cè)miR-204和2的靶向關(guān)系。合成含miR-204結(jié)合位點(diǎn)的2 3’UTR啟動(dòng)子區(qū)序列，構(gòu)建2 3’UTR野生型(WT)質(zhì)粒(2-WT)。并在該質(zhì)?；A(chǔ)上，突變結(jié)合位點(diǎn)，按質(zhì)粒提取試劑盒方法構(gòu)建2 3’UTR 突變型(MUT)質(zhì)粒(2-MUT)。將2-WT、2-MUT質(zhì)粒分別和mimics NC、miR-204 mimics質(zhì)粒混勻后共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌組織中miR-204、SOCS2表達(dá)情況 各組小鼠的miR-204、SOCS2表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見表1及圖1。所有I/R小鼠的miR-204表達(dá)均低于Sham組，而2 mRNA及其蛋白表達(dá)高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。I/R組與mimics-NC組之間miR-204、2表達(dá)情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)，miR-204 mimics組的miR-204表達(dá)高于mimics-NC組，2 mRNA及蛋白表達(dá)低于mimics-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

圖1 各組心肌組織中SOCS2蛋白的表達(dá)Figure 1 SOCS2 protein expression in myocardial tissues of each group

表1 各組小鼠心肌組織中miR-204、SOCS2 表達(dá)的比較Table 1 Comparison of miR-204 and SOCS2 expression in myocardial tissue of mice in each group

2.2 各組小鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物的比較 各組心肌損傷因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)的表達(dá)情況比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見表2。所有I/R小鼠的心肌損傷因子表達(dá)水平均高于Sham組， mimics-NC組的心肌損傷因子水平均高于miR-204 mimics組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；I/R組與mimics-NC組的心肌損傷因子水平比較無顯著性差異(>0.05)。

表2 各組小鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物的比較Table 2 Comparison of myocardial injury markers in serum of each group of

2.3 各組小鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)的比較 HE染色結(jié)果顯示：Sham組心肌組織染色均勻，心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無病理變化；I/R組、mimics-NC組心肌纖維排列紊亂，正常的心肌結(jié)構(gòu)遭到破壞，梗死病灶存在大量炎性細(xì)胞的浸潤，心肌細(xì)胞較為腫脹，且存在瘢痕組織；miR-204 mimics組心肌纖維結(jié)構(gòu)的受損及炎性細(xì)胞的浸潤程度有所減輕，見圖2。

Masson染色結(jié)果顯示：Sham組心肌組織纖維排列整齊，著色均勻，未存在膠原成分；I/R組、mimics-NC組藍(lán)色區(qū)域增多，說明膠原成分增加，心肌纖維化程度明顯，且心肌細(xì)胞明顯減少；miR-204 mimics組心肌纖維化程度減輕，見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織鏡下觀(HE×200，Masson×200)Figure 2 Microscopic view of myocardial tissue of mice in each group (HE×200, Masson×200)

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子的比較 各組的炎癥因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見表3。所有I/R小鼠的炎癥因子表達(dá)水平高于Sham組，mimics-NC組的炎癥因子表達(dá)水平高于miR-204 mimics組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；I/R組與mimics-NC組的炎癥因子水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。

表3 各組小鼠血清中炎癥因子的比較Table 3 Comparison of serum inflammatory factors in each group of mice pg/mL)

2.5 miR-204與SOCS2的關(guān)系 通過Targetscan預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-204可以結(jié)合SOCS2，見圖3a。熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SOCS2-WT和miR-204 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；而SOCS2-MUT和miR-204 mimics共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無明顯變化(>0.05)，見圖3b。

a. Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-204與SOCS2的靶向關(guān)系；b.雙熒光素酶驗(yàn)證miR-204與SOCS2的靶向關(guān)系。圖3 Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-204與SOCS2的靶向關(guān)系Figure 3 Prediction of targeting relationship between miR-204 and SOCS2 by Targetscan website

3 討論

miRNA屬于一類長度約為21 nt的RNA，可通過調(diào)控靶基因在機(jī)體的病理反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。其中有研究報(bào)道m(xù)iR-204多與癌癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)miR-204在癌組織中常呈低表達(dá)水平，而在癌旁組織中呈高表達(dá)水平，對(duì)癌細(xì)胞的侵襲遷移具有抑制作用，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。還有研究認(rèn)為miR-204對(duì)心血管疾病的發(fā)生也具有一定的調(diào)控作用，Yu等研究發(fā)現(xiàn)沉默lncRNA AK139328可顯著增加miR-204-3p的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞自噬，對(duì)糖尿病型I/R具有緩解作用。

SOCS家族是一類新型的小分子量多肽，近年來研究報(bào)道SOCS與心血管疾病發(fā)生密切相關(guān)。2屬于SOCS家族中的一員，其可作為調(diào)控糖尿病I/R損傷的關(guān)鍵基因，且可通過 JAK-STAT 通路沉默IGF-1的表達(dá)進(jìn)而加重糖尿病I/R損傷。然而近些年來關(guān)于miR-204調(diào)控2參與I/R的作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)探究了上調(diào)miR-204表達(dá)水平對(duì)小鼠心肌組織中SOCS2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-204在I/R模型小鼠中呈低表達(dá)，在健康小鼠中呈高表達(dá)，而2與其表達(dá)趨勢(shì)恰好相反，且上調(diào)I/R小鼠中miR-204的表達(dá)可顯著抑制其SOCS2的表達(dá)水平。提示miR-204可能通過抑制SOCS2的表達(dá)對(duì)小鼠I/R的病理機(jī)制發(fā)揮作用。具體作用原因有待進(jìn)一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，所有I/R小鼠的BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均顯著高于Sham組；miR-204 mimics組BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均顯著低于mimics-NC組。這一結(jié)果說明上調(diào)miR-204的表達(dá)可有效降低心肌損傷標(biāo)志物BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平，對(duì)I/R小鼠心肌組織損傷的恢復(fù)具有促進(jìn)意義。分析原因可能與上調(diào)miR-204表達(dá)對(duì)SOCS2的表達(dá)具有抑制作用有關(guān)，因?yàn)镾OCS2的高表達(dá)對(duì)I/R病情的加重具有調(diào)控作用。

心肌組織病理學(xué)異常及心肌纖維化程度加劇均為I/R損傷常見的病理特征，本研究發(fā)現(xiàn)，I/R小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，病灶區(qū)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞的浸潤，心肌細(xì)胞腫大，且心肌纖維化明顯，而miR-204 mimics組小鼠上述病理狀態(tài)較陰性對(duì)照組明顯減輕。提示上調(diào)miR-204的表達(dá)對(duì)減輕I/R小鼠心肌組織病理損傷及心肌纖維化具有促進(jìn)意義。研究報(bào)道，炎癥反應(yīng)在I/R發(fā)病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，其中促炎因子，如TNF-a、IL-1β、IL-6，已成為心肌功能異常的關(guān)鍵損害因子。促炎因子的釋放將對(duì)心肌組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞因子的浸潤具有促進(jìn)作用，還能造成毛細(xì)血管阻塞及細(xì)胞毒性物質(zhì)的合成，最終引發(fā)急性組織損傷。本研究結(jié)果顯示，I/R小鼠的TNF-a、IL-1β、IL-6水平均顯著高于Sham組；I/R組與mimics-NC組之間的炎癥因子水平無顯著性差異，miR-204 mimics組炎癥因子水平均顯著低于mimics-NC組。提示，miR-204的高表達(dá)可有效降低血清中炎癥因子水平，降低炎性反應(yīng)。分析原因可能是因?yàn)閙iR-204對(duì)2具有負(fù)調(diào)控作用，而有研究報(bào)道2可通過抑制JAK/STAT通路來降低TNF-a、IL-6等炎癥因子水平。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-204與2之間的作用關(guān)系，本研究通過生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)二者之間存在結(jié)合位點(diǎn)，且采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明了2是miR-204的靶基因。進(jìn)一步說明，miR-204對(duì)I/R病理機(jī)制的調(diào)控是通過靶向抑制2表達(dá)來發(fā)揮作用的。

綜上所述，上調(diào)miR-204的表達(dá)，能減輕小鼠I/R病理學(xué)狀態(tài)，改善心肌損傷指標(biāo)水平，降低炎癥反應(yīng)，其作用原因可能與抑制2的表達(dá)有關(guān)。