陳 翔，劉 耀，倪 睿，趙祎博，曹梓珍，陳劍鴻

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

抗菌藥物的大量使用導(dǎo)致耐藥菌出現(xiàn)，使得細(xì)菌感染的治療更加困難［1］。因此，需要尋找新的抗菌藥物及開發(fā)新型抗菌制劑，以應(yīng)對抗菌藥物耐藥菌帶來的挑戰(zhàn)。聚六亞甲基雙胍（PHMB）是一種陽離子聚合物，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較強的抗菌活性，可與帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)滲漏，從而殺死細(xì)菌［2-3］。PHMB 具有抗菌活性強、細(xì)胞毒性低、生物相容性好等優(yōu)點［4-5］，已被用作傷口消毒劑和治療傷口感染的泡沫敷料［6-7］。絲素蛋白（SF）是從蠶繭中提取的蛋白質(zhì)，生物相容性良好，生物降解性可控，力學(xué)性能優(yōu)異［8-9］。SF 作為一種性能良好的生物材料，已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用作藥物的載體材料，如用于制備薄膜、纖維、多孔海綿、水凝膠、納米粒子等［10］。本研究中將PHMB 負(fù)載于SF 納米粒子（PHMB - NPs），并對PHMB-NPs 進行表征，考察其體外抗菌活性和累積釋放率，為新型抗菌敷料的開發(fā)提供理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與菌種

儀器：SW-CJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Nano ZS90 型激光粒度儀（英國Malvin公司）；Gemini型掃描電鏡（德國Zeiss公司）；IRAffinity-1S型紅外光譜儀（日本Shimadzu 公司）；THZ - C 型 氣浴恒溫振蕩器（常州市中貝儀器有限公司）；PYX -DHS.400 - BS 型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；Allegra X - 30R 型高速冷凍離心機（美國Beckman 公司）；84-1A 型磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；VCX750 型超聲破碎儀（美國Sonics 公司）；VORTEX-5 型渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Synergy H1 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；CoolSafe Pro 110-4 型冷凍干燥機（丹麥LaboGene公司）。

材料和試劑：蠶繭由西南大學(xué)肖波教授贈予；PHMB（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C12298306，純度為98%）；碳酸鈉（批號為H120BA0007，純度不低于99.8%），三水合醋酸鈉（批號為H115BA0010，純度不低于99%），均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；無水氯化鈣（批號為402L021，純度不低于96%），曙紅Y（批號為A916L032，純度不低于88%），透析袋（批號為1123C028），LB 肉湯（批號為1228O031），LB 營養(yǎng)瓊脂（批號為1223A031），均購于北京索萊寶科技有限公司；丙酮（重慶川東化工＜集團＞有限公司，批號為20161201，純度不低于99.5%）。

菌種：大腸桿菌E577 由中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科提供。

1.2 方法

1.2.1 絲素提?。?1］

將蠶繭置0.5%碳酸鈉溶液中煮沸30 min，用蒸餾水清洗，重復(fù)此步驟3次，以徹底除去絲膠。絲素纖維在60 ℃下干燥4 h，用氯化鈣-無水乙醇-水溶液（1∶2∶8，V/V/V）在60 ℃條件下溶解1 h。將得到的溶液放入透析袋（截留相對分子量為8 000～14 000）中，置蒸餾水中透析72 h，得絲素溶液，凍干，得絲素凍干粉。

1.2.2 PHMB-NPs制備［12］

將絲素蛋白凍干粉溶于適量水中，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的SF 溶液。將適量PHMB 加入SF 溶液中，使PHMB 的質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。在渦旋條件下，將2 mL 含有PHMB 的SF 溶液緩慢滴加到10 mL 丙酮中，混合溶液隨即呈現(xiàn)乳白色，繼續(xù)渦旋1 min，冰浴條件下超聲處理1 min，于通風(fēng)裝置中攪拌3 h 以揮發(fā)丙酮。隨后，4 ℃離心（轉(zhuǎn)速為6 000 r/ m）10 min，收集上清液；4 ℃離心（轉(zhuǎn)速為12 500 r/m）20 min，收集納米粒子。為增加PHMB的負(fù)載量進行二次載藥，將凍干后的納米粒子放入不同PHMB 溶液中（1%，0.5%，0.25%，0.1%，0.05%，0.025%，0.01%，m/V）攪拌20 h，4 ℃，離心（轉(zhuǎn)速為12 500 r/ min）20 min，收集納米粒子，凍干，即得PHMB - NPs（1%，m/V），PHMB - NPs（0.5%，m/V），PHMB-NPs（0.25%，m/V），PHMB-NPs（0.1%，m/V），PHMB - NPs（0.05%，m/V），PHMB - NPs（0.025%，m/V），PHMB-NPs（0.01%，m/V），置-20 ℃條件下保存，備用。

1.2.3 納米粒子粒徑、多分散指數(shù)（PDI）、Zeta 電位、藥物負(fù)載量測定

取PHMB - NPs，均勻分散在蒸餾水中，測量前用樣品溶液潤洗樣品池。取適量溶液于樣品池中，采用激光粒度儀測定，重復(fù)3次。

納米粒子中PHMB的含量測定參考《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)·胍類消毒劑衛(wèi)生要求》（GB/ T 26367 —2020）。取少量PHMB - NPs，用1 mL DMSO 溶解，取適量，加入三水合醋酸鈉溶液（10%，m/V）、曙紅Y 溶液（0.024%，m/V）、水，按DMSO溶液、三水合醋酸鈉溶液、曙紅Y溶液、水體積比為2∶1∶2.5∶19.5（V/V/V/V），混勻，采用酶標(biāo)儀于545 nm 波長處測定吸光度（OD），并計算PHMB含量。

1.2.4 PHMB-NPs 的形貌觀察

取少量制備的PHMB - NPs 樣品，滴加于硅片上，自然風(fēng)干。將載有樣品的硅片用導(dǎo)電膠固定在銅釘臺上，行噴金處理，采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察PHMB-NPs的形貌。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜檢測

取1 mg PHMB-NPs 和50 mg 溴化鉀，置瑪瑙研缽中，充分研磨，放入模具，壓片。采用傅里葉紅外光譜儀進行檢測，設(shè)置掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.6 抗菌活性試驗［13］

采用牛津杯抑菌圈法觀察納米粒子對大腸桿菌E577 的抗菌活性。取各PHMB-NPs 3 mg，加入200μL蒸餾水，吹打均勻。取0.1 mL 107cfu/ mL 大腸桿菌E577 菌懸液，滴加于LB 營養(yǎng)瓊脂平板上，用涂布棒將菌懸液涂布均勻，將牛津杯置瓊脂平板上，吸取各PHMBNPs 混懸液200μL，加至牛津杯內(nèi)。將此瓊脂平板放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小，用游標(biāo)卡尺測量并計算抑菌圈寬度，重復(fù)3 次。抑菌圈寬度=抑菌圈直徑-牛津杯直徑。

1.2.7 PHMB-NPs 體外釋放曲線建立［14］

分別稱取PHMB - NPs（1%，m/V），PHMB - NPs（0.5%，m/V），PHMB - NPs（0.25%，m/V）各100 mg，加入適量蒸餾水，使納米粒子分散均勻。將混懸液放入透析袋（截留相對分子量為3 500～5 000）中，用細(xì)線扎緊透析袋兩端，將此透析袋放入裝有10 mL pH 為7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）的試管中，置氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為37 ℃。在預(yù)定時間點，吸取1 mL 樣品溶液測定含量，加入1 mL 新鮮PBS溶液，并保持試管內(nèi)體積不變。

向樣品中加入三水合醋酸鈉溶液（10%，m/V）、曙紅Y 溶液（0.024%，m/V）、水，按DMSO 溶液、三水合醋酸鈉溶液、曙紅Y 溶液、水體積比為10∶1∶2.5∶11.5（V/V/V/V），混勻，采用酶標(biāo)儀于545 nm 波長處測定OD，并計算PHMB 含量。

2 結(jié)果

2.1 粒徑、PDI、Zeta 電位、藥物負(fù)載量

納米粒子的粒徑、PDI、Zeta 電位、藥物負(fù)載量見表1。納米粒子的粒徑范圍為150～170 nm，PDI 值均小于0.16，說明粒徑的分布范圍較窄。SF-NPs 的Zeta 電位為負(fù)值，PHMB-NPs的Zeta電位均為正值，說明負(fù)載PHMB 后，SF - NPs 表面的負(fù)電荷被中和，并由負(fù)電變?yōu)檎?。二次載藥時，納米粒子的藥物負(fù)載量隨PHMB溶液質(zhì)量體積比的增加而增加。

表1 納米粒子的粒徑、PDI、Zeta電位和藥物負(fù)載量（±s，n=3）Tab.1 Particle size，PDI，Zeta potential and drug-loading content of nanoparticles（±s，n=3）

表1 納米粒子的粒徑、PDI、Zeta電位和藥物負(fù)載量（±s，n=3）Tab.1 Particle size，PDI，Zeta potential and drug-loading content of nanoparticles（±s，n=3）

納米粒子SF-NPs PHMB-NPs 0.01%0.025%0.05%0.1%0.25%0.5%1%粒徑（nm）159.7±7.159 159.6±4.687 162.4±5.116 163.7±5.021 160.3±2.892 153.5±8.902 159.3±10.03 169.0±9.945 PDI 0.120±0.006 0.128±0.013 0.141±0.012 0.090±0.015 0.120±0.023 0.155±0.034 0.110±0.031 0.098±0.038 Zeta電位-19.0±0.306 45.4±0.321 51.3±0.987 53.3±1.530 49.7±0.666 48.6±0.700 48.8±0.306 46.5±0.700藥物負(fù)載量（%）2.30±0.34 2.56±0.41 3.25±0.2 3.67±0.27 5.82±0.31 7.41±0.42 11.51±0.25

2.2 形貌

納米粒子的形貌見圖1?？梢?，所有納米粒子均呈球形顆粒狀，平均粒徑小于100 nm。

a.SF-NPs b.PHMB-NPs（0.01%） c.PHMB-NPs（0.025%） d.PHMB-NPs（0.05%） e.PHMB-NPs（0.1%）f.PHMB-NPs（0.25%） g.PHMB-NPs（0.5%） h.PHMB-NPs（1%）圖1 納米粒子的SEM圖（×50 000）a.SF-NPs b.PHMB-NPs（0.01%） c.PHMB-NPs（0.025%） d.PHMB-NPs（0.05%） e.PHMB-NPs（0.1%） f.PHMB-NPs（0.25%）g.PHMB-NPs（0.5%） h.PHMB-NPs（1%）Fig.1 SEM photographs of nanoparticles（×50 000）

2.3 傅里葉變換紅外光譜

納米粒子的紅外光譜圖見圖2，1 645，1 521，1 232 cm-1波數(shù)處的特征吸收峰分別對應(yīng)SF 中3 個酰胺鍵的伸縮振動吸收峰。隨著納米粒子中PHMB負(fù)載量的增加，SF 的特征吸收峰并無明顯區(qū)別，說明負(fù)載PHMB后SF的分子構(gòu)象未發(fā)生明顯改變。

圖2 納米粒子的紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of nanoparticles

2.4 抗菌活性試驗

由圖3 可知，PHMB - NPs（1%，m/V），PHMB -NPs（0.5%，m/V），PHMB-NPs（0.25%，m/V）均顯示出抑菌圈，其余質(zhì)量體積比PHMB-NPs 及SF-NPs 均未顯示出抑菌圈。PHMB-NPs對大腸桿菌E577的抑菌圈寬度見表2。

表2 納米粒子對大腸桿菌E577的抑菌圈寬度（±s，n=3）Tab.2 Width of inhibition zone of nanoparticles against Escherichia coli E577（±s，n=3）

表2 納米粒子對大腸桿菌E577的抑菌圈寬度（±s，n=3）Tab.2 Width of inhibition zone of nanoparticles against Escherichia coli E577（±s，n=3）

納米粒子PHMB-NPs SF-NPs 1%0.5%0.25%0.1%0.05%0.025%0.01%抑菌圈寬度（mm）5.52±0.187 2.26±0.226 0.39±0.185 0 0 0 0 0

圖3 PHMB-NPs對大腸桿菌E577的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of PHMB-NPs on Escherichia coli E577

2.5 體外釋放曲線

由于PHMB - NPs（0.1%，m/V），PHMB - NPs（0.05%，m/V），PHMB-NPs（0.025%，m/V），PHMBNPs（0.01%，m/V）均未顯示出抗菌活性，故不評價其體外釋放情況。PHMB 的體外釋放曲線見圖4。PHMB在PBS中的釋放主要集中在24 h內(nèi)，之后PHMB持續(xù)釋放，但釋放率不高，釋放168 h 后PHMB - NPs（1%，m/V），

PHMB-NPs（0.5%，m/V），PHMB-NPs（0.25%，m/V）的累積釋放率分別為（8.74±0.04）%、（4.60±0.06）%、（3.89±0.04）%。

3 討論

傷口的治療會給醫(yī)療保障部門帶來巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。在美國，所有傷口類型的醫(yī)療保險支出總額估計為281億至968億美元，且隨著人口老齡化的加劇，全球用于傷口治療的支出正在迅速增加［15］。傷口一旦被細(xì)菌感染，可導(dǎo)致組織損傷、基質(zhì)重塑、膠原纖維降解等，延長其愈合時間［16］。由于越來越多的細(xì)菌對抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，傳統(tǒng)的抗菌藥物治療達(dá)不到期望的療效［17］。此外，治療開放性傷口感染時，殺菌劑不會產(chǎn)生臨床相關(guān)耐藥性的風(fēng)險，抗菌譜更廣，皮膚致敏率更低，比抗菌藥物更具優(yōu)勢［18-19］。故選用PHMB為模型藥物以制備抗菌制劑。

A.168 h內(nèi) B.24 h內(nèi)圖4 PHMB-NPs在37 ℃PBS中的體外釋放曲線（n=3）A.Within 168 h B.Within 24 hFig.4 In vitro release profiles of PHMB - NPs in PBS at 37 ℃（n=3）

SF是來源于蠶繭的天然蛋白質(zhì)，由1個重鏈（350 000）、1 個輕鏈（26 000）和1 個P25 基因編碼的糖蛋白組成。SF 主要有Silk Ⅰ和Silk Ⅱ2 種構(gòu)象，Silk Ⅰ溶于水，包含無規(guī)則卷曲、α螺旋和其他非晶態(tài)結(jié)構(gòu)；而Silk Ⅱ不溶于水，主要包含β折疊結(jié)構(gòu)［20］。通過混合水溶性的SF和與水互溶的有機溶劑，可以制備納米粒子，期間SF的構(gòu)象可從Silk Ⅰ立即轉(zhuǎn)化為Silk Ⅱ，生成不溶于水的納米粒子［21］。SF具有良好的生物相容性、可控的降解性和可調(diào)節(jié)的藥物釋放特性，已廣泛用于藥物遞送系統(tǒng)的制備［22］。有研究表明，納米顆粒具有與傷口治療相關(guān)的有益特性，如藥物的控制釋放［23］。故本研究中選擇以SF為藥物載體制備負(fù)載PHMB的納米粒子。

本研究中使用激光粒度儀測定了納米粒子的粒徑、PDI和Zeta 電位。通過檢測發(fā)現(xiàn)，所有納米粒子粒徑均在160 nm 左右，且具有良好的單分散性。此外，在負(fù)載PHMB 后，SF 表面的電位由負(fù)值變?yōu)檎?。所有納米粒子Zeta 電位的絕對值接近或大于20 mV，表明納米粒子的分散體系具有良好的穩(wěn)定性。通過觀察SEM 圖像中顯示的粒徑，納米粒子平均粒徑小于100 nm，與激光粒度儀測定的粒徑差別較大，可能是由于用激光粒度儀測定時納米粒子在水中呈膨脹狀態(tài)，用SEM 觀察形貌時納米粒子經(jīng)過干燥而處于收縮狀態(tài)。

通過對比不同納米粒子的紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)，差異不明顯，沒有因為負(fù)載PHMB含量的增加而出現(xiàn)明顯變化，說明PHMB的加入不會改變SF的分子構(gòu)象。

牛津杯抑菌圈試驗表明，PHMB-NPs 在質(zhì)量體積比高于0.2%（m/V）的PHMB 溶液中進行二次載藥，所得納米粒子才具有抗菌活性。因此，選取了PHMB-NPs（1%，m/V），PHMB - NPs（0.5%，m/V），PHMB - NPs（0.25%，m/V）3 種納米粒子進行PHMB 的體外釋放試驗，發(fā)現(xiàn)PHMB 的釋放主要集中在24 h 內(nèi)，且納米粒子上負(fù)載的PHMB 含量越高，累積釋放率也越高。這可能是因為，當(dāng)PHMB 含量較低時，帶正電的SF 和帶負(fù)電的PHMB間的靜電相互作用較強，使得PHMB難以克服SF的束縛而釋放；而當(dāng)PHMB 含量較高時，SF 表面的負(fù)電被PHMB 中和，SF 與PHMB 的靜電相互作用變?nèi)?，?dǎo)致PHMB釋放增加［24］。

本研究中成功制備了負(fù)載PHMB 的PHMB - NPs，并考察了其抗菌活性和體外釋放性。結(jié)果表明，PHMB-NPs具有良好的抗菌作用，是一種具有應(yīng)用潛力的抗菌制劑。本研究為進一步將其開發(fā)成新型抗菌敷料提供了實驗依據(jù)。