蘇冠旬 李麗娜 陳 宇 趙博旭 張耀夫 趙進喜 黃為鈞 王世東

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腎病內(nèi)分泌二科，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathies，DN）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。DN 發(fā)病機制復(fù)雜，其中免疫炎癥損傷一直是DN 發(fā)病機制的研究熱點。研究表明，p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activation protein kinase，p38 MAPK）通路是腎臟免疫炎癥的重要途徑，在炎癥、纖維化和應(yīng)激反應(yīng)中都具有著重要作用[2-6]，其可以促進腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、細胞間黏附分子-1（intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1）等細胞因子表達，從而加劇DN 的惡化，而ICAM-1、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 等因子表達的增強能反作用于p38 MAPK 信號通路，促進通路的激活，加快腎纖維化的進展[7-10]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，祛風(fēng)通絡(luò)方（牛蒡子、蠶砂、穿山龍）在治療DN 方面具有一定的效果，可降低尿蛋白、延緩腎小球纖維化，其機制與下調(diào)TGF-β1、MCP-1 等炎癥因子的表達有關(guān)[11-13]。為進一步從分子生物學(xué)角度揭示祛風(fēng)通絡(luò)方治療DN 的機制及“從風(fēng)論治”法治療DN 的合理性，本研究對祛風(fēng)通絡(luò)方改善高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細胞炎癥反應(yīng)的分子機制進行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株

人腎小球系膜細胞株，購自北京裕恒豐科技有限公司（貨號：4200），傳至第三代用于實驗。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)液（25 mmol/L 葡萄糖）（美國Hyclone 公司，批號：NVL0337）；低糖DMEM培養(yǎng)液（美國Hyclone 公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：10099-141）；TNF-α、TGF-β1、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號：88-7346、88-8350、88-7261、88-7066）；ICAM-1抗體（美國Proteintech 公司，貨號：10020-1-AP），p38 MAPK 抗體（美國CST 公司，貨號：3690），β-actin 抗體、MCP-1 抗體、HRP 標(biāo)記羊抗鼠、羊抗兔IgG（美國Abcam 公司，貨號：ab9669、ab6276、ab6789、ab6721）；p38 MAPK 通路抑制劑SB203580（上海陶素公司，批號：152121-47-6）。

1.2.2 主要儀器 雙垂直電泳槽（品牌：CAVOY；型號：MP-8001）；轉(zhuǎn)移槽（品牌：CAVOY；型號：MP-3030）；溫控搖床（品牌：其林貝爾；型號：TS-2000A）；電泳儀（品牌：CAVOY；型號：PP-1150）；熒光定量PCR 儀（廠家：Bioer Technology；儀器型號：Line Gene 9600 Plus）。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清制備 SPF 級Wistar 雄性大鼠，體重290～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。實驗動物倫理號：BUCM-4-2021060901-2049。實驗動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物飼養(yǎng)室，室溫18～22℃，濕度40%～60%，自然光照，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)并觀察1 周，然后運用隨機數(shù)字表法將其分為兩組。一組予祛風(fēng)通絡(luò)方47.2 g/（kg·d）灌胃，另一組灌服同體積的生理鹽水，2 次/d，連續(xù)3 d。末次灌胃2 h 后，麻醉后在大鼠股動脈進行無菌采血。將采集到的血液在4℃下靜置4 h，在3000 r/min（離心半徑8.5 cm）條件下離心20 min，分離血清，56℃水浴中滅活30 min，過濾除菌，-20℃保存。祛風(fēng)通絡(luò)方（組成：牛蒡子、蠶砂、穿山龍）顆粒劑，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥劑科提供。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及分組 將人腎小球系膜細胞接種于含有10%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM 培養(yǎng)基中，存放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后分別對各組進行處理：正常組（低糖DMEM 培養(yǎng)液+正常大鼠血清）、模型組（高糖DMEM 培養(yǎng)液+正常大鼠血清）、抑制劑組（高糖DMEM 培養(yǎng)液+正常大鼠血清+5 μmol/L SB203580 預(yù)處理）、祛風(fēng)通絡(luò)組（高糖DMEM 培養(yǎng)液+服用祛風(fēng)通絡(luò)方的大鼠血清）。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 的表達水平 取生長良好四組細胞，以5×105個/孔密度接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后收集細胞上清液，依據(jù)IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 試劑盒說明書進行測定。每組6 個復(fù)孔。

1.4.2 Western blot 檢 測ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK 的表達水平 四組培養(yǎng)48 h 后收集并提取細胞蛋白，按常規(guī)方法進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，然后顯色、拍照。上述過程重復(fù)3 次。結(jié)果采用Quantity One v.4.6.2 軟件分析相對灰度值，并進行統(tǒng)計。

1.4.3 RT-PCR 檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK 的mRNA 表達水平 取生長良好四組細胞，培養(yǎng)48 h 后收集，提取RNA，用cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，按照說明依次加入各組分。引物由北京基譜生物科技有限公司提供，序列及長度見表1。將反應(yīng)體系進行95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，共45 個循環(huán)，分別測定待測樣本目的基因及內(nèi)參的Ct 值，按照2-ΔΔCt相對定量的計算公式，計算各組基因表達水平量的差異。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比較

模型組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。祛風(fēng)通絡(luò)組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比較（pg/ml，，n=6）

表2 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比較（pg/ml，，n=6）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1

2.2 四組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比較

模型組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。祛風(fēng)通絡(luò)組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1、表3。

表3 四組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比較（，n=3）

表3 四組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比較（，n=3）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。p38 MAPK：p38 絲裂原活化蛋白激酶；ICAM-1：細胞間黏附分子-1；MCP-1：單核細胞趨化蛋白-1

2.3 四組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA 表達水平比較

模型組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA 表達水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。祛風(fēng)通絡(luò)組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA表達水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2～3。

3 討論

本研究基于《黃帝內(nèi)經(jīng)》理論，對于DN 提出了“腎絡(luò)伏風(fēng)”病機學(xué)說，認為消渴病日久，熱傷氣陰，久病及腎，腎絡(luò)虧虛，外風(fēng)與內(nèi)風(fēng)乘虛侵襲人體，伏于腎之絡(luò)脈，形成“腎絡(luò)伏風(fēng)”，治療當(dāng)重視祛風(fēng)通絡(luò)法，臨床常使用各類“風(fēng)藥”，如牛蒡子、穿山龍、蠶砂等，取得了良好的效果[14-17]。

炎癥信號通路受復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，p38 MAPK 是其中重要的調(diào)節(jié)機制之一，可使炎癥反應(yīng)形成惡性循環(huán)。IL-1β、IL-6、TGF-β1 參與了腎小球系膜細胞的異常增殖和細胞外基質(zhì)的過度沉積[18-21]，而TNF-α 與DN 的腎肥大及超濾密切相關(guān)，是造成DN 蛋白尿發(fā)生的重要因子之一[22]。MCP-1 是導(dǎo)致DN 慢性炎癥反應(yīng)的重要原因之一，其可通過激活及趨化單核/巨噬細胞，釋放多種炎癥介質(zhì)如IL-6、ICAM-1 等，刺激腎小球毛細血管基膜變厚、腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)生成增多，從而加快腎小球的硬化[23-24]。在DN 中，高表達的ICAM-1 可促使單核細胞向腎臟游走，引發(fā)單核細胞、淋巴細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的黏附，使炎癥細胞在腎臟浸潤，產(chǎn)生細胞因子，加重內(nèi)皮細胞損傷[25]。

本研究結(jié)果顯示，在高糖誘導(dǎo)后，人腎小球系膜細胞中的IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 表達升高，p38 MAPK 信號通路激活。祛風(fēng)通絡(luò)方含藥血清干預(yù)后，可明顯減輕高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細胞的炎癥反應(yīng)，并且可以抑制p38 MAPK 信號通路的激活，提示祛風(fēng)通絡(luò)方可能通過抑制p38 MAPK 信號通路，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上，本研究顯示祛風(fēng)通絡(luò)方可以降低高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)，其機制與p38 MAPK 信號通路相關(guān)。