劉 濤 李 晶 鮑翠玉

1.湖北科技學院附屬第二醫(yī)院口腔科，湖北咸寧 437100；2.湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北咸寧 437100

牙周病是一種由多種因素引起成年人牙齒脫落的炎癥性疾病[1]。據(jù)報道[2-3]，糖尿病促進了牙周病的發(fā)生和嚴重的牙槽骨丟失[4]，血糖、血脂過高導致牙周附著喪失[5]，而且脂毒性對機體的危害遠遠高于糖毒性[6]。人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）是牙周組織中一種自我更新多向分化的間充質(zhì)干細胞[7-8]，已證實其凋亡是牙周器質(zhì)性病變的重要因素[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)牙周病的防治與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑的激活有關(guān)[10]。棕櫚酸（palmitic acid，PA）通過ERS 誘導細胞凋亡引發(fā)多種疾病[11]，也可誘導hPDLSCs 凋亡和抑制其成骨分化[12]，但是ERS 對PA 誘導的hPDLSCs 凋亡的作用機制目前尚未明確。本研究通過觀察PA 對hPDLSCs的存活率、細胞凋亡熒光變化、ERS 凋亡相關(guān)蛋白的表達，探討PA 是否通過ERS 凋亡通路促進hPDLSCs凋亡。以期為糖尿病性牙周病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株

hPDLSCs（上海莼試生物技術(shù)公司）。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，SH30021.01）；胎牛血清（Gibco，26140-079）；PA（Sigma，P5585）；4-PBA（Sigma，P21005-25G）；Annexin VFITC-PI 試劑盒（貝博，BB4101-50T）；MTT 粉末（眾一生物科技，M1124）、BCA 試劑盒（碧云天，P0012S）；抗ATF4（1181S）、PERKphos（3179S）、IRE1phos（3294S）、ATF6（11587-1-AP）、Cleaved caspase-3（9661S）均購于CST，CHOP（Proteintech，15204-1-AP），β-actin（Abclonal，AC026）；CO2細胞培養(yǎng)箱（BBD6220）；倒置熒光顯微鏡（CKX41）；多功能酶標儀（Synergy 2）；自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Biosens SC920）；垂直式電泳儀（1645050）。

1.3 實驗分組

本課題組前期預試驗發(fā)現(xiàn)PA 抑制hPDLSCs 細胞增殖呈時間和濃度依賴性，基于本課題組前期研究[13]，本實驗PA 刺激時間選擇24 h。①為探究PA 抑制hPDLSCs 增殖的作用機制，將細胞隨機分為對照組（不含PA 的培養(yǎng)基）和PA 低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 mmol/L）組。②為探究4-PBA 對PA 所致hPDLSCs凋亡的影響，將細胞分為隨機對照組（不含PA 的培養(yǎng)基）、PA（0.4 mmol/L）組、PA（0.4 mmol/L）+4-PBA（5 μmol/L）組。

1.4 MTT 法檢測hPDLSCs 增殖率

在96 孔板中接種hPDLSCs 心肌細胞，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁24 h 后，將細胞按照“①”進行分組，每組設置6 個復孔，對照組加入不含PA 的培養(yǎng)基，PA 各濃度組分別加入0.1、0.2、0.4 mmol/L 的PA 處理細胞24 h。實驗結(jié)束后棄去孔內(nèi)上清液，加入20 μl/孔濃度為5 g/L MTT 溶液，避光孵育4 h 后棄液，加入150 μl DMSO，搖震10 min，570 nm 處測量各孔光密度值，細胞增殖率按前期本課題組計算方法計算[13]。

1.5 Annexin V FITC-PI 觀察hPDLSCs 凋亡情況

按500 μl/孔將hPDLSCs 接種在24 孔板內(nèi)，孵育過夜，將細胞按照“①”進行分組，對照組加入不含PA的培養(yǎng)基，PA 各濃度組分別加入0.1、0.2、0.4 mmol/L的PA 處理細胞24 h。每組設置3 個復孔，繼續(xù)孵育24 h，按照試劑盒操作說明，洗滌細胞3 次，4%多聚甲醛固定10 min，再洗滌3 次。依次加入Annexin V-FITC結(jié)合液、Annexin V-FITC 和PI，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。封片，熒光拍照并分析保存圖像。

1.6 Western blot 法檢測蛋白表達

探究PA 抑制hPDLSCs 增殖的作用機制時，將細胞按照“①”進行分組，對照組加入不含PA 的培養(yǎng)基，PA 各濃度組分別加入0.1、0.2、0.4 mmol/L 的PA 處理細胞24 h。洗凈各組細胞，加入RAPI 裂解液，收集細胞，冰上裂解15 min，提取上清液蛋白樣本，用BCA試劑盒測定蛋白。上樣量為20 μg、SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、1×TBST 洗膜、脫脂牛奶封閉膜2 h，一抗（1∶1000）4℃搖床孵育過夜，二抗（1∶5000）室溫搖床孵育1 h，洗滌后用ECL 顯影液處理，經(jīng)凝膠成像儀分析成像，計算ATF4、CHOP、PERKphos、IRE1phos、ATF6、Cleaved caspase-3 與內(nèi)參灰度值比值，每組實驗重復3 次。探究4-PBA 對PA 所致hPDLSCs 凋亡的影響，將細胞按照“②”進行分組，對照組加入不含PA 的培養(yǎng)基，PA 組加入0.4 mmol/L 的PA 處理細胞24 h，PA+4-PBA 組加入0.4 mmol/L 的PA 和5 μmol/L的4-PBA 處理細胞24 h。實驗方法同上，計算CHOP、PERKphos、Cleaved caspase-3 與內(nèi)參灰度值比值，每組實驗重復3 次。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 5 對結(jié)果作圖并進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩兩比較采用LSD-t 分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PA 對hPDLSCs 增殖率的影響

與正常組比較，PA 低、中、高濃度組均明顯抑制hPDLSCs 增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），其中PA 高濃度組細胞存活率已降到50%以下。見圖1。

2.2 PA 對hPDLSCs 凋亡的影響

對照組FITC 標記的綠色熒光和PI 標記的紅色熒光均較弱，而在PA 低濃度組開始出現(xiàn)綠色熒光，PA 中濃度組明顯增強并發(fā)現(xiàn)紅色熒光，PA 高濃度組兩種熒光明顯增強，細胞數(shù)目明顯減少，細胞凋亡相關(guān)形態(tài)學改變。見圖2。

2.3 PA 對hPDLSCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路激活的影響

PA 高濃度組IRE1phos、PERKphos、ATF6、ATF4、CHOP蛋白表達較正常組明顯上調(diào)，中、高濃度組Cleaved caspase-3 蛋白表達較正常組均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），而低、中濃度組IRE1phos、PERKphos、ATF6、ATF4、CHOP 蛋白和低濃度組Cleaved caspase-3蛋白的表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），與PA 低、中濃度組比較，PA 高濃度組IRE1phos、PERKphos、ATF6、ATF4、CHOP、Cleaved caspase-3 蛋白表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

2.4 4-PBA 對PA 誘導的hPDLSCs 凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

PA 組PERKphos、CHOP、Cleaved caspase-3 蛋白表達較對照組明顯升高（P ＜0.05），而ERS 抑制劑4-PBA 預處理后，PA+4-PBA 組PERKphos、CHOP、Cleaved caspase-3 較PA 組蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖4。

3 討論

隨著對糖尿病牙周病的深入研究發(fā)現(xiàn)，血液中游離脂肪酸代謝紊亂是糖尿病患者常伴有的癥狀，主要表現(xiàn)為高脂血癥[5]。有研究報道游離脂肪酸通過抑制TIMP-1 表達來促進人牙周膜成纖維細胞凋亡[14]，高濃度的脂肪酸引起牙周微血管功能障礙，牙槽骨喪失，hPDLSCs 凋亡及相關(guān)凋亡基因表達上調(diào)[15]，動物實驗也證實高脂飲食的糖尿病大鼠牙槽骨丟失[16]。因此，評估高脂對牙周組織的不良作用機制很重要，本實驗選擇PA 作為脂毒性刺激因素，發(fā)現(xiàn)hPDLSCs 的增殖率與PA 刺激的濃度有關(guān)，PA 高濃度組中凋亡熒光顯著增強，顯示PA 能誘導hPDLSCs 凋亡，提示造模成功。

近年來發(fā)現(xiàn)脂肪酸可以通過多種機制誘導細胞凋亡，尤其ERS 通路因與炎癥牙周膜細胞凋亡密切相關(guān)而備受關(guān)注[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞的重要細胞器，在蛋白質(zhì)合成、折疊和成熟過程中起著重要作用。Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白的積累時，導致ERS。在正常情況下，ERS 通過增加蛋白質(zhì)折疊能力，激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）來恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。PERK、ATF6、IRE1 是三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的跨膜蛋白，其作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊蛋白的傳感器，被GRP78 覆蓋。但在錯誤折疊蛋白的存在下，這些伴侶被分離，相應的UPR 信號通路被激活，從而通過ERS 特異促凋亡因子即CCAAT/CHOP促進細胞凋亡[18-20]。在本研究中，高濃度組ERS 相關(guān)蛋 白IRE1phos、PERKphos、ATF-6、ATF-4、CHOP 表達增加，此結(jié)果顯示高濃度的PA 可以激活ERS 信號通路，引起相關(guān)蛋白表達增加。

caspase 家族在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，其與多種蛋白因子共同調(diào)控細胞凋亡[21]。激活的PERK、IRE1和ATF6 通過上調(diào)下游分子CHOP 來增強caspase-3的轉(zhuǎn)錄活性。高表達的caspase-3 可介導細胞凋亡的級聯(lián)反應，促進細胞凋亡[22-23]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞可以引發(fā)ERS，導致Cyt-C 等凋亡因子從線粒體膜內(nèi)釋放，從而激活caspase 凋亡信號通路[24]。本研究結(jié)果提示高濃度的PA 可以誘導hPDLSCs 凋亡。4-PBA 是一種眾所周知的ERS 抑制劑，在ERS 引起的多種疾病中有著重要治療潛力[25]。本研究顯示，PA+4-PBA 組與PA 組比較，PERKphos、CHOP、Cleaved caspase-3的表達明顯降低，提示4-PBA 可以抑制高濃度的PA激活的ERS 信號通路，逆轉(zhuǎn)hPDLSCs 凋亡，此結(jié)果進一步提示高濃度的PA 造成hPDLSCs 凋亡可能通ERS凋亡途徑。

綜上所述，高脂能夠抑制hPDLSCs 增殖，并促進其凋亡，其作用機制可能與ERS 凋亡途徑的活化有關(guān)。因此，ERS 通路在糖尿病牙周病的發(fā)病過程中具有重要作用，這為理解糖尿病牙周病的形成機制提供新的線索，也可能為臨床預防和治療糖尿病牙周病提供新策略。