朱雨菲 郭宇鑫 王利瑩 李 矜 張濤靜

1.北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100078

國際糖尿病聯(lián)合會統(tǒng)計2019 年中國20～79 歲糖尿病患病人數(shù)約1.16 億，位居世界榜首[1]。病程進展中60%～70%的患者會患上神經(jīng)病變，以糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）最多見[2]，DPN 以肢體末端麻木疼痛、腱反射減弱消失為主要癥狀[3]，給患者健康及生活造成負擔[4]。DPN 是多因素共同作用的結(jié)果，晚期糖基化終產(chǎn)物途徑、氧化應激、炎癥作用、RNA 非編碼調(diào)節(jié)等因素均發(fā)揮了直接或間接的作用[5-7]。高糖環(huán)境提高背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（dorsal root ganglion neuron，DRGn）細胞凋亡水平是導致DPN 及其進展的重要機制[8-9]。本研究旨在觀察糖絡寧對高糖下DRGn 細胞凋亡水平及絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路的調(diào)節(jié)作用，以探索糖絡寧治療DPN 的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及環(huán)境

臨產(chǎn)期SPF 級和60 只（215±15）g 清潔級6～8 周SD 雄性大鼠，動物許可證號：SCXK（京）20160006，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于大鼠SPF 級屏障環(huán)境中[動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0013]，溫度（20±2）℃，濕度45%～65%，12 h 明暗交替。實驗流程由北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院倫理委員會論證通過（編號：BUCM201738）。

1.2 主要藥物及試劑

由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院制劑室提供約為生藥0.5 g/ml 糖絡寧制劑（黃芪15 g、生地黃12 g、當歸15 g、狗脊15 g、牛膝12 g、木瓜15 g、丹參15 g、川續(xù)斷10 g）。兔抗p-JNK1（貨號：ab110724）、JNK1（貨號：ab47337）、p-c-Jun（貨號：ab32137）、c-Jun（貨號：ab30620）、p-Map3k8（貨號：ab217684）、Map3k8（貨號：ab51214）購自Abcam 公司。葡萄糖（貨號：15023021），Neurobasal 培養(yǎng)基（貨號：21103049）購自Gibco。Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡檢測試劑盒（貨號：FXP018）購自北京四正柏生物科技有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：MD913053）購自MDL。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡（DS126281）購自日本Canon 公司，電泳儀（BG-subMIDI）購自北京百晶生物技術(shù)有限公司，低溫離心機（3-30K）購自德國Sigma 公司，體視顯微鏡（XTL-165）購自江西鳳凰光學科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-It310）購自美國UVP 公司。

1.4 研究方法

1.4.1 制備含藥血清 制備含藥血清參照前期研究[10-11]。60 只大鼠適應性喂養(yǎng)7 d 后，采用隨機數(shù)字表法分為正常組和高、中、低濃度糖絡寧組，每組15 只。糖絡寧組分別予組方生藥5、2.5、1.25 g/（kg·d）灌胃，正常組予等量蒸餾水灌胃，2 次/d，連續(xù)10 d，期間自由飲食。末次灌胃后2 h 內(nèi)自大鼠腹主動脈取血，以3000 r/min離心10 min（離心半徑95 mm），分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，-80℃存用。

1.4.2 DRGn 細胞取材、培養(yǎng) 細胞取材培養(yǎng)參照既往研究[12-13]及前期實驗[10-11]。將培養(yǎng)好的細胞隨機分為正常組，高糖組，低、中、高濃度糖絡寧組。正常組用含10%正常大鼠血清和Neurobasal 培養(yǎng)基（含25%葡萄糖），高糖組按前期結(jié)果[11]在正常組基礎(chǔ)上加50 mmol/L葡萄糖，糖絡寧組在高糖組基礎(chǔ)上加10%低、中、高濃度糖絡寧含藥血清。各組均設(shè)置3 個復孔。分別培養(yǎng)24 h。

1.4.3 流式法檢測DRG 細胞凋亡水平 將培養(yǎng)24 h 的細胞消化收集，制備細胞懸液（1×105/ml～5×105/ml）。按Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡檢測試劑盒說明書操作，室溫避光將5 μl Annexin V/FITC 和100 μl 細胞懸液混勻，孵育5 min 后加入400 μl PBS 和10 μl PI，1 h內(nèi)檢測凋亡情況。采用CellQuest 軟件繪制雙色散點圖。實驗重復3 次。

1.4.4 Western blot 法檢測DRG 中MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達水平 冰浴條件下裂解細胞，提取總蛋白。制備SDS-PAGE 電泳，據(jù)BCA 蛋白定量結(jié)果，將樣品加入SDS-PAGE 凝膠加樣孔中，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下于5%脫脂奶粉中搖床上封閉1 h，分別孵育一抗p-JNK1（1∶1000）、JNK1（1∶1000）、p-c-Jun（1∶500）、c-Jun（1∶1000）、p-Map3k8（1∶1000）、Map3k8（1∶100），4℃過夜，TBST 洗滌10 min，重復3 次，同樣條件下孵育二抗（1∶4000）1 h，TBST 洗膜，電化學發(fā)光增強劑顯色、成像。Image-Pro Plus6.0 軟件分析所得蛋白條帶灰度值。實驗重復3 次。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組DRGn 細胞凋亡率比較

高糖組細胞凋亡率顯著高于正常組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；糖絡寧各組細胞凋亡率明顯低于高糖組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），中濃度糖絡寧組細胞凋亡率低于高、低濃度糖絡寧組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表1、圖1。

表1 各組細胞凋亡率比較（%，，n=3）

表1 各組細胞凋亡率比較（%，，n=3）

注 與正常組比較，aaP ＜0.01；與高糖組比較，bbP ＜0.01；與低濃度糖絡寧組比較，ccP ＜0.01；與高濃度糖絡寧組比較，ddP ＜0.01

2.2 各組MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達比較

高糖組p-JNK1、p-c-Jun、Map3k8、p-Map3k8 表達及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8比值明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05或P ＜0.01），高糖組與正常組JNK1、c-Jun 表達，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；糖絡寧各濃度組p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 表達及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8 比值明顯低于高糖組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）；中濃度糖絡寧組p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 表達及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8 比 值明顯低于高、低濃度糖絡寧組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；中、低濃度糖絡寧組c-Jun 表達低于高糖組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），糖絡寧各濃度組JNK1、Map3k8 及c-Jun 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達比較（，n=3）

表2 各組MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達比較（，n=3）

注 與正常組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與高糖組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與低濃度糖絡寧組比較，ccP ＜0.01；與高濃度糖絡寧組比較，ddP ＜0.01

3 討論

臨床研究[14-15]證實糖絡寧療效顯著，但其機制仍有待研究。既往實驗發(fā)現(xiàn)，糖絡寧通過促進PI3K/AKT信號通路，抑制PERK 通路[16]，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中IRE1α等蛋白表達[17]，降低Bax/Bcl-2 比值[18]等，抑制細胞凋亡。

研究表明MAPKs 信號通路的激活與神經(jīng)細胞凋亡有密切聯(lián)系[19-20]。MAPKs 通路主要包括ERK1/2、JNK、p38MAPK[21-23]，可通過連續(xù)酶促反應，將胞外信號通過磷酸化傳至胞內(nèi)，參與增殖、分化、凋亡等過程。JNK1、Map3k8 為該通路中參與調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵性激酶。Map3k8 磷酸化后激活MAPK 激酶1/2[24]，進而激活并磷酸化ERK1/2。實驗[25-27]顯示高糖環(huán)境可激活JNK、ERK1/2 途徑，誘導細胞凋亡。c-Jun 為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，能被JNK1 磷酸化，調(diào)節(jié)下游凋亡靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導FasL、TNF 等死亡配體表達，與死亡受體Fas、TNFR 合成死亡誘導信號復合物，最終使caspase酶活化，通過死亡受體途徑介導細胞凋亡[28]。

本研究結(jié)果顯示，高糖刺激可提高DRGn 細胞凋亡水平和p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 蛋白表達，提示高糖可使MAPKs 通路激活，上調(diào)細胞凋亡水平。經(jīng)糖絡寧含藥血清作用后，糖絡寧各濃度組細胞凋亡水平及p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 蛋白表達明顯低于高糖組，糖絡寧含藥血清對細胞凋亡及MAPKs 通路的作用與高糖刺激下相反，即糖絡寧對該通路有抑制作用，同時可抑制DRGn 細胞凋亡。MAPKs 通路在細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，結(jié)合本研究結(jié)果顯示高糖刺激可激活該通路誘導細胞凋亡，而糖絡寧可通過抑制MAPKs 信號通路來降低DRGn 細胞凋亡水平，從而延緩DPN 進展。這可能是糖絡寧治療DPN的機制之一，但其具體作用成分尚未明確，仍有待研究。