劉 霜，劉林莉，劉 琴，彭文海，麻秀萍，徐 劍，張永萍，楊雅欣

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

白及為蘭科植物白及屬白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.的塊莖，收載于《中國藥典》2020版，具有收斂止血、消腫生肌的功效，常應(yīng)用于吐血， 咯血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂[1]。白及藥用部位為塊莖，須根為廢棄部位，為了合理開發(fā)利用資源，對白及須根進(jìn)行研究極有意義。

白及多糖有較好的促進(jìn)止血、凝血作用[2-3]，其白及須根與白及塊莖成分相似[4]，白及須根具抗氧化、抗腫瘤、抗菌等作用，且白及須根醇提物抗菌活性優(yōu)于白及塊莖[5-9]；白及塊莖多糖含量高于須根[10]；白及須根總酚含量高于白及塊莖[11]，說明白及須根存在開發(fā)價(jià)值。王瑋[12]經(jīng)過單因素、正交試驗(yàn)優(yōu)選出白及多糖提取的最佳工藝技術(shù)參數(shù)，料液比(藥材質(zhì)量g/所用溶劑的體積mL)為1∶15，在90 ℃水浴下提取2次，每次1.5 h。張媛媛等[13]在茶多糖測定中，發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法在反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、測定精確度以及樣品回收率方面均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

目前未見比較白及須根粗多糖與白及塊莖粗多糖止血研究，因此提取白及須根與塊莖粗多糖，用苯酚硫酸法測其多糖含量，并比較其體外凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察白及須根粗多糖是否具有體外凝血作用。期望須根成為白及的藥用部位，為白及的開發(fā)與質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和統(tǒng)計(jì)方法

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司，型號：UV756CRT)，分析天平(上海菁海儀器有限公司，型號：FA2204N；瑞士梅特勒公司，型號：AG285)，打粉機(jī)(永康市久品工貿(mào)有限公司，型號：JP-500C)，鼓風(fēng)干燥箱(上?；厶﹥x器制造有限公司，型號：DHG-9035A)，離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司，型號：TD4A；鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號：TD5A)，水浴鍋(上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：DRHH-2)，微量采血吸管(姜堰市健華醫(yī)療器械有限公司，140908)，扁形稱量瓶。

1.2 藥品和試劑

D-無水葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：ESAV-3WNK)，硫酸(重慶川東化工(集團(tuán))有限公司，試劑類型：分析純)，苯酚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試劑類型：分析純)，云南白藥(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，ZHA2003)，檸檬酸二鈉(上海麥克林生化科技有限公司，C11499087)，CaCl2(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20171023)，蒸餾水。

1.3 樣品來源

所購白及片及須根由貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為蘭科植物白及屬白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.的植物，樣品來源如表1。

表1 樣品來源Tab.1 Sources of samples

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(湘)2019-0014，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物室內(nèi)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用IBM SPSS Statistics 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，顯著水平P=0.05。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 白及多糖含量測定方法與結(jié)果

2.1 白及粗多糖的提取

稱定過40目白及粉10 g(白及須根粉20 g)，料液比1∶15(g/mL)，以蒸餾水為提取溶劑，在90 ℃水浴下提取兩次，每次1.5 h，提取液于離心機(jī)3500 r/min轉(zhuǎn)速下，離心20 min，得上清液后濃縮，加入濃縮液3倍量95%乙醇醇沉，放置一晚，濾過，60 ℃干燥，得白及粗多糖，稱量，計(jì)算白及粗多糖得率，粉碎后備用。

按上述方法提取白及粗多糖，并計(jì)算粗多糖得率，結(jié)果見表2。

表2 40目白及塊莖與白及須根粗多糖得率(n=3)Tab.2 Yield of crude polysaccharide from the tuber andthe fibrous root of Bletilla striata(n=3)

白及粗多糖得率=(W2/W1)*100%

其中，W1為扣除藥材水分的白及粉重量，W2為白及粗多糖重量。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取D-無水葡萄糖1.65 mg，于10 mL棕色容量瓶中，加水定容即得165 μg/mL的陽性對照溶液，冰箱冷藏備用。

2.3 供試品溶液的配制

2.3.1 白及塊莖粗多糖供試液的制備

精密稱取白及塊莖粗多糖0.1 g，置50 mL容量瓶中，加熱水溶解(加熱水后若不溶則于水浴鍋中90 ℃水浴溶解)，放冷加水至刻度，取1 mL置15 mL離心管中，加無水乙醇5 mL，搖勻，冷藏1 h取出，3500 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌兩次，每次4 mL，3500 r/min離心20 min，離心棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，冷卻后定容至刻度，即得白及塊莖粗多糖供試液。

2.3.2 白及須根粗多糖供試液的制備

精密稱取白及須根粗多糖0.1 g，置25 mL容量瓶中，加熱水溶解(加熱水后若不溶則于水浴鍋中90 ℃水浴溶解)，放冷加水定容至刻度，后續(xù)步驟同2.3.1。

2.4 檢測波長的確定

取適當(dāng)濃度供試品和對照品溶液各1 mL，分別置于不同具塞玻璃試管中，按苯酚-硫酸法顯色[12]，以相應(yīng)試劑為空白，分別于200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果如圖1、圖2、圖3，將488 nm作為檢測波長。

圖1 白及須根粗多糖紫外吸收圖譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of crude polysaccharidefrom the fibrous root of Bletilla striata

圖2 白及塊莖粗多糖紫外吸收圖譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of crude polysaccharidefrom the tuber of Bletilla striata

圖3 D-無水葡萄糖紫外吸收圖譜Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum of D-anhydrous glucose

2.5 多糖含量測定

2.5.1 線性關(guān)系

精密取D-無水葡萄糖溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL至具塞試管中，依次加水補(bǔ)足1 mL，以相應(yīng)試劑為空白，同2.4顯色后，測定吸光度，以吸光度對濃度回歸，得方程，如表3。結(jié)果表明葡萄糖濃度在16.5～99.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(線性曲線如圖4)。

表3 葡萄糖線性關(guān)系結(jié)果Tab.3 Linear relation results of glucose

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of glucose

2.5.2 白及塊莖粗多糖與須根粗多糖中多糖的含量

將配制好的供試液顯色后，測定其吸光度，結(jié)果如表4。

表4 白及塊莖粗多糖與白及須根粗多糖中多糖含量測定結(jié)果(n=3)Tab.4 The content of polysaccharide from the tuber andthe fibrous root of Bletilla striata(n=3)

3 白及塊莖和須根粗多糖體外凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別取白及塊莖粗多糖、白及須根粗多糖、云南白藥10 mg各一組，置于5 mL的離心管中，將粉末盡量鋪開均勻分布于離心管底部，離心管中分別加入3滴3.8%的檸檬酸二鈉溶液。大鼠進(jìn)行目內(nèi)眥眼圈取血，分別加入1 mL血液于上述離心管中，再加入25 μL 0.2 mol/L CaCl2溶液用來絡(luò)合之前加入的抗凝劑，并立即混勻，從加入CaCl2溶液后開始計(jì)時(shí)。先靜置1 min，每隔30 s傾斜試管，至血液凝聚不能流動(dòng)，立即停止計(jì)時(shí)，記錄各組凝血時(shí)間，以不加被研究藥物為陰性對照組，以云南白藥為陽性對照組，每組測8個(gè)樣品(注：此處所用白及粗多糖來源于BJ012，BJ012-1)，結(jié)果見表5。

表5 白及塊莖粗多糖與須根粗多糖體外凝血時(shí)間分析結(jié)果(n=8)Tab.5 In vitro blood coagulation time of the crude polysaccharidefrom the tuber and the fibrous root of Bletilla striata(n=8)

4 結(jié)論與討論

白及藥材水分均<15.0%，符合藥典規(guī)定[14]，白及提取物粗多糖水分(按白及藥材算)<15.0%。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中過40目的粗多糖得率均高于過24目的，因此粉碎粒度選為過40目，經(jīng)多糖含量測定得白及塊莖粗多糖得率及多糖含量均高于白及須根。

經(jīng)顯著性差異分析得陰性對照組與陽性對照組、白及塊莖粗多糖組、白及須根粗多糖組，有顯著性差異(P<0.05)；陽性對照組與白及塊莖粗多糖組和白及須根粗多糖組，無顯著性差異(P>0.05)；白及塊莖粗多糖組和白及須根粗多糖組，無顯著性差異(P>0.05)。表明白及塊莖粗多糖和白及須根粗多糖均具有體外凝血作用，初步研究表明兩者體外凝血作用可能相當(dāng)，又因水提醇沉還可提取出其他非多糖物質(zhì)，說明白及須根粗多糖中可能含有其他止血成分，需要進(jìn)一步研究。