王 媛，劉美娟，王宏進，殷光玲，李 妍，張旭光，孫立新

(1.沈陽藥科大學，遼寧 本溪 110016；2.湯臣倍健股份有限公司，廣東 廣州 300146)

姜黃提取物主要包括姜黃素(CUR)、去甲氧基姜黃素(DMC)、雙去甲氧基姜黃素(BDMC)等姜黃素類化合物[1]，具有降脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病、抗病毒等多種藥理活性[2]。有研究表明，姜黃素氫化代謝物四氫姜黃素表現(xiàn)出多種優(yōu)于姜黃素的生物活性[3]，二氫姜黃素可抑制細胞凋亡[4]、對油酸誘導的HepG2細胞的脂堆積、氧化應激損傷、胰島素抵抗具有一定的預防作用[5]。篩選出活性、穩(wěn)定性、生物利用度高于CUR、DMC、BDMC的代謝產(chǎn)物，在一定程度上能夠解決CUR、DMC、BDMC穩(wěn)定性差、生物利用度低的問題。

目前，與CUR相關的代謝產(chǎn)物研究較多[6-9]，而DMC和BDMC的研究較少，且僅報道了其在大鼠糞便、尿液中的一相代謝物[10-11]及其納米制劑[8]在大鼠糞便、尿液、血漿中的二相代謝物。對于姜黃提取物，僅報道了3種姜黃素類化合物在大鼠糞便、尿液中的一相代謝物[11]和人血漿[12]中的代謝產(chǎn)物，且分離出的代謝物較少[10-11]、質(zhì)譜數(shù)據(jù)不完善[12]。因此，本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Extrative Orbitrap MS)技術鑒定姜黃提取物中3種姜黃素類化合物的代謝產(chǎn)物，以期對姜黃素類化合物的代謝產(chǎn)物進行補充，為后期篩選活性代謝物研究提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Vanquish Flex超高效液相色譜儀、Q-ExactiveTM四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(HESI)、TraceFinder 4.1工作站及TraceFinder 4.1 General Quan數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；CPA225D型電子分析天平(1/10萬)：德國賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16型高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

姜黃素對照品(純度≥98%)：中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素、四氫姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素對照品(純度≥98%)：上海源葉生物有限公司產(chǎn)品；姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四叔丁基銨對照品(純度≥98%)：多倫多研究化學公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸、乙腈(色譜純)：美國Sigma公司產(chǎn)品；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司產(chǎn)品。

姜黃提取物：湯臣倍健股份有限公司產(chǎn)品，主要由姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素3種化學成分組成，經(jīng)工作曲線法測定，其含量分別為192.5±1.6、44.99±0.56、44.29±0.7 mg/g(平均值±標準差，n=3)。

1.3 實驗動物

SPF級SD(Sprague-Dawley)大鼠(雄性，體質(zhì)量220～250 g，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(遼) 2020-0001)：由沈陽藥科大學動物實驗中心提供。

1.4 實驗方法

1.4.1對照品溶液的制備 取適量的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素、四氫姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素、姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四丁基銨對照品，分別置于10 mL棕色容量瓶中，除姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉對照品用20%甲醇-水溶液溶解外，其他對照品均用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為87.0、72.0、102.0、61.0、80.0、109.0、99.0、89.0、107.0 mg/L對照品儲備液，于4 ℃儲存，待用。

混合對照品溶液的制備：精密量取各0.2 mL姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素、姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四丁基銨對照品儲備液，各0.3 mL去甲氧基姜黃素、四氫姜黃素，0.4 mL二氫姜黃素，置于100 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.174、0.204、0.218、0.198、0.178、0.214、0.216、0.240、0.244 mg/L混合對照品溶液，于4 ℃儲存，待用。

1.4.2灌胃溶液的制備 精密稱取適量的姜黃提取物，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(取約0.5 g羧甲基纖維素鈉，加入100 mL純凈水中，80 ℃加熱使其溶解，制成質(zhì)量分數(shù)約為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)混懸，配制成約142 g/L混懸液。

1.4.3動物分組和給藥 取18只健康雄性SD大鼠，隨機分成6組(n=3)，依次編號為K1、K2、K3、Y1、Y2、Y3。K1、K2、K3組分別用于收集空白糞便和尿液、空白血漿、空白膽汁；Y1、Y2、Y3組分別用于收集給藥糞便和尿液、給藥血漿、給藥膽汁。

實驗前所有動物于SPF級動物房中適應性飼養(yǎng)7天，給藥前禁食12 h，可自由飲水。禁食12 h后，Y1、Y2、Y3組大鼠灌胃給予姜黃提取物-0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，給藥劑量1 703 mg/kg(姜黃素327.8 mg/kg、去甲氧基姜黃素76.6 mg/kg、雙去甲氧基姜黃素75.4 mg/kg)。K1、K2、K3組大鼠灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.4.4生物樣品采集 將K1和Y1組大鼠置于代謝籠中，分別收集0～12 h時空白糞便和尿液、給藥糞便和尿液，并將收集的糞便樣品置于室溫下避光風干，所有樣品于-20 ℃儲存，待用。

K2和Y2組大鼠分別于灌胃后0.25、1、2、3、4、6、8、12、24 h時從眼眶后靜脈叢取0.5 mL血，置于經(jīng)肝素鈉處理的EP管中，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，得到空白血漿和給藥血漿樣品，于-20 ℃儲存，待用。

K3和Y3組大鼠經(jīng)麻醉后做膽汁插管手術，分別收集0～12 h時空白膽汁和給藥膽汁樣品，于-20 ℃儲存，待用。

1.4.5樣品處理 血漿樣品：避光操作。分別取100 μL 9個不同時間點的血漿樣品，置于同一棕色EP管中，加入3 mL甲醇，渦旋2 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一棕色EP管中，室溫下氮氣吹干；殘渣用200 μL 75%甲醇復溶，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清液，備用。

糞便樣品：避光操作。將風干后的糞便置于研缽中研碎，混合均勻。取約1 g混合均勻的糞便樣品，置于25 mL燒杯中，加入5 mL甲醇，超聲提取30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，室溫下氮氣吹干；殘渣用2 mL甲醇復溶，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清液，備用。

尿液、膽汁樣品：避光操作。精密量取各1 mL尿液、膽汁樣品，分別置于25 mL燒杯中，加入5 mL甲醇，超聲提取30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，室溫下氮氣吹干；尿液殘渣用200 μL甲醇復溶，膽汁殘渣用2 mL甲醇復溶，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min, 離心2次，取上清液，備用。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～6 min(10%～30%B)，6～14 min(30%～65%B)，14～17 min(65%～95%B)，17～20 min(95%B)，20～20.1 min(95%～10%B)，20.1～23.1 min(10%B)；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(HESI源)，負離子模式檢測，鞘氣流速9 L/min，輔助氣流速3 L/min，噴霧電壓3.8 kV，毛細管溫度320 ℃，輔助氣溫度310 ℃。采用自動觸發(fā)二級(Full scan-ddMS2(TopN))數(shù)據(jù)采集模式；一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z150.0～2 000.0，分辨率70 000；二級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500，分辨率17 500；碰撞氣為高純氮氣；碰撞能20、30、40 eV；Top(N):10，自動選擇質(zhì)譜產(chǎn)生的前10個最強離子峰作為二級質(zhì)譜的母離子進行碎裂。

2 結(jié)果與討論

2.1 對照品質(zhì)譜裂解行為

在負離子模式下，對照品CUR、DMC、BDMC、二氫姜黃素、四氫姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素、姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四叔丁基銨的色譜保留時間及準分子離子峰[M-H]-分別為13.68、13.43、12.95、13.42、13.17、9.59、8.95、10.38、11.19 min和m/z367.116 5、337.104 9、307.097 4、369.130 5、371.147 6、373.166 4、375.178 2、565.132 8、447.073 5。同時發(fā)現(xiàn)對照品二氫姜黃素與四氫姜黃素分別在10.65、10.84 min處有1個色譜峰，其各自的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(一級及二級質(zhì)譜碎片)分別與二氫姜黃素、四氫姜黃素的質(zhì)譜數(shù)據(jù)相同。研究表明，姜黃素類為庚二酮類化合物，在溶液中同時存在酮式和烯醇式結(jié)構[13-16]，推測保留時間10.65、10.84 min處分別為二氫姜黃素、四氫姜黃素烯醇式結(jié)構的色譜峰。各對照品提取離子流色譜圖示于圖1。負離子模式下，姜黃素類化合物主要從碳碳單鍵處發(fā)生裂解，各對照品的具體裂解規(guī)律示于附圖1(請登錄《質(zhì)譜學報》網(wǎng)站http:∥www.jcmss.com.cn下載)。

注：1.八氫姜黃素；2.六氫姜黃素；3.姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉；4.姜黃素四叔丁基銨；5.雙去甲氧基姜黃素；6.去甲氧基姜黃素；7.姜黃素；8.二氫姜黃素(酮式)；8-1.二氫姜黃素(烯醇式)；9.四氫姜黃素(酮式)；9-1.四氫姜黃素(烯醇式)圖1 各對照品提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of references

2.2 代謝產(chǎn)物分析

首先，根據(jù)原型藥物結(jié)構推測可能的代謝產(chǎn)物，檢索姜黃素類化合物代謝產(chǎn)物文獻，建立包括化合物名稱、分子式、精確分子質(zhì)量、一級和二級質(zhì)譜碎片的代謝物數(shù)據(jù)庫；其次，利用TraceFinder 4.1 General Quan數(shù)據(jù)處理軟件，同時在空白樣品和給藥樣品的總離子流圖中提取數(shù)據(jù)庫中代謝產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，得到僅在給藥樣品中色譜峰的保留時間、質(zhì)譜碎片信息，并結(jié)合文獻、對照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)及姜黃素類化合物的裂解規(guī)律[13-14]，鑒定代謝產(chǎn)物，對照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。姜黃提取物在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物扣除空白后的總離子流色譜圖示于圖2。

表1 負離子模式下，各對照品一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 MS1 and MS2 data of references in negitive ion mode

注：a.血漿；b.糞便；c.膽汁；d.尿液圖2 姜黃提取物在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物扣除空白后的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of metabolites subtracted background of turmeric extract in rats

2.3 姜黃提取物在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定

本研究共鑒定出59個代謝產(chǎn)物，包括16個雙去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物(B1～B16)、15個去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物(D1～D15)、16個姜黃素代謝產(chǎn)物(C1～C16)、12個無法歸屬的代謝產(chǎn)物(W1～W12)。代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于附表1。B3、B7、B8、B11～B13、C3、D3、D5、D8、D10、W1～W5、W7、W10、W12代謝產(chǎn)物的鑒定如下(其他代謝物二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)均與文獻[8,10,17-23]數(shù)據(jù)一致)。

B3保留時間為6.14 min，其準分子離子峰[M-H]-m/z565.099 9，推測分子式可能為C25H25O13S，比對照品BDMC準分子離子峰大258 u(176+80+2)，表明B3可能為BDMC硫酸酯化葡萄糖醛酸化氫化代謝產(chǎn)物。B3的二級碎片離子m/z485.145 0、389.067 9分別比準分子離子峰少80 u、176 u，證實B3中含有硫酸和葡萄糖醛酸；碎片離子m/z309.111 6比BDMC準分子離子峰多2 u，表明BDMC雙鍵處發(fā)生還原，其母核結(jié)構可能為二氫雙去甲氧基姜黃素。進一步裂解發(fā)現(xiàn)，m/z199.006 2由m/z565.099 9從C2、C3處裂解得到，m/z199.006 2失去1分子硫酸后得m/z119.049 7，因此，推測B3為二氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯。由碎片離子m/z199.006 2可知，硫酸與雙鍵左側(cè)的羥基結(jié)合。

B7保留時間為7.05 min，其準分子離子峰[M-H]-m/z491.191 3，推測分子式可能為C25H32O10，比對照品BDMC準分子離子峰大184 u(176+8)，表明可能為BDMC葡萄糖醛酸化氫化代謝物。B7的二級碎片離子m/z315.158 3比準分子離子峰多176 u，比對照品BDMC準分子離子峰多8 u，表明B7可能為八氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸代謝物。進一步比較B7與B1(八氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸)的質(zhì)譜碎片，發(fā)現(xiàn)B7的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z491.191 3、315.158 3與B1的碎片離子m/z491.191 0[M-H-SO3]-、315.159 7[M-H-SO3-GluA]-相同，且B1中m/z315.159 7同樣未進一步發(fā)生裂解，二者裂解方式相同。在保留時間6.29 min處，其準分子離子峰、碎片離子均與B7相同，因此推測6.29 min處為B7烯醇式結(jié)構色譜峰。

同理，可分別鑒定B8、B11為二氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸、四氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。保留時間7.91 min處為B11烯醇式結(jié)構色譜峰。B8碎片離子m/z203.070 5、119.049 8由B8準分子離子峰[M-H]-m/z487.159 1失去1分子葡萄糖醛酸后，分別從C6、C7及C2、C3處發(fā)生斷裂得到；B11碎片離子m/z205.086 1、163.075 7由B11準分子離子峰[M-H]-m/z487.159 1失去1分子葡萄糖醛酸后，分別從C6、C7及C4、C5處發(fā)生斷裂得到。

B12保留時間為10.49 min，其準分子離子峰[M-H]-m/z389.067 7，推測分子式可能為C19H17O7S，比對照品BDMC準分子離子峰多82 u(80+2)，表明可能為BDMC硫酸酯化氫化代謝物。B12碎片離子m/z309.112 1比其準分子離子峰少80 u，比對照品BDMC準分子離子峰多2u，比對照品BDMC準分子離子峰多2 u，推測可能為二氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯代謝物。碎片離子m/z269.011 9為準分子離子峰m/z389.067 7從C5、C6處斷裂得到，且可知硫酸與雙鍵一側(cè)羥基結(jié)合；m/z203.070 6為準分子離子峰m/z389.067 7從雙鍵處發(fā)生斷裂得到，因此推測B12可能為二氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯，其二級碎片離子m/z189.055 1由m/z269.011 9失去1分子硫酸得到。同理，B13為四氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯，保留時間8.38 min處為B13烯醇式結(jié)構色譜峰。

C3準分子離子峰[M-H]-m/z625.120 7，推測分子式可能為C27H29O15S，與對照品CUR準分子離子峰相比多258 u(176+80+2)，推測為CUR硫酸酯化葡萄糖醛酸化氫化代謝物。C3的碎片離子m/z545.165 6、449.091 0與準分子離子峰分別相差80 u、176 u，證實C3中含有葡萄糖醛酸和硫酸酯結(jié)構。二級碎片離子m/z369.131 3、219.065 5、149.060 2、113.024 1與二氫姜黃素對照品的二級質(zhì)譜碎片相同，因此推測C3為二氫姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯。m/z229.016 5表明葡萄糖醛酸與雙鍵左側(cè)羥基結(jié)合。

D3準分子離子峰[M-H]-m/z595.112 5，推測分子式可能為C26H27O14，與對照品DMC準分子離子峰相比多258 u(176+80+2)，推測為DMC葡萄糖醛酸硫酸酯化氫化代謝物。m/z419.078 7[M-H-GluA]-、339.120 2[M-H-GluA-SO3]-證實結(jié)構中含有葡萄糖醛酸和硫酸，且其碎片離子m/z339.120 2比去甲氧基姜黃素準分子離子峰多2 u，因此推測D3為二氫去甲氧基姜黃葡萄糖醛酸硫酸酯。m/z229.016 5表明葡萄糖醛酸與雙鍵左側(cè)羥基結(jié)合、甲氧基位于雙鍵左側(cè)，由準分子離子峰從C2、C3處裂解得到。

D5準分子離子峰[M-H]-m/z519.183 5，推測分子式為C26H31O11，利用TraceFinder 4.1 General Quan數(shù)據(jù)處理軟件對m/z519.183 5進行元素成分分析，發(fā)現(xiàn)D5與六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸的分子質(zhì)量誤差小于5×10-6，初步推測為六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。用ChemDraw軟件繪制六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸結(jié)構，并進行碎片裂解，發(fā)現(xiàn)D5碎片離子m/z179.070 7為m/z519.183 5失去1分子葡萄糖醛酸后，從C3、C4處發(fā)生斷裂得到，m/z179.070 7進一步失去1分子OCH3后，得到碎片離子m/z149.060 7，因此推測D5為六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。

D8保留時間為9.85 min，準分子離子峰[M-H]-m/z421.095 6，推測分子式為C20H21O8S，比對照品DMC準分子離子峰多84 u(80+4)，表明其可能為DMC氫化硫酸酯化代謝物。碎片離子m/z341.136 5[M-H-SO3]-證實存在硫酸酯，碎片離子m/z341.136 5比DMC準分子離子峰多4 u，因此推測D8為四氫去甲氧基姜黃素硫酸酯。其二級碎片離子m/z235.097 6由準分子離子峰失去1分子硫酸后，從C6、C7處發(fā)生斷裂得到；m/z219.101 1由準分子離子峰失去1分子硫酸后，從C5、C6處發(fā)生斷裂，同時C5上羰基失去1分子氫與C3環(huán)合成丁烯內(nèi)酯結(jié)構得到。同理，保留時間7.13 min處為D8烯醇式結(jié)構色譜峰，m/z259.027 6表明硫酸與甲氧基一側(cè)的羥基結(jié)合，由m/z421.095 6從C3、C4處裂解得到。

D10與D8擁有相同的碎片離子m/z341.137 4、235.096 7，推測D8與D10具有相同的母核結(jié)構，且其準分子離子峰[M-H]-m/z517.171 8比碎片離子m/z341.137 4多176 u，表明D10為葡萄糖醛酸代謝物，因此推測其為四氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。

W1～W5：W5保留時間為4.92 min，準分子離子峰[M-H]-m/z273.043 8，推測分子式為C11H13O6S。W5準分子離子峰與C8特征碎片離子m/z273.043 0相同，表明該化合物結(jié)構可能與C8特征碎片離子結(jié)構相同。碎片離子m/z193.086 2[M-H-SO3]-證實存在硫酸，m/z178.063 0為m/z273.043 8失去1分子硫酸后，再失去1分子CH3得到，因此推測W5為4-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-丁-2-酮硫酸酯，其二級質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律示于圖3。W3保留時間為4.66 min，準分子離子峰m/z369.117 0，推測分子式為C17H21O9。二級碎片離子m/z193.086 7[M-H-GluA]-表明W3為葡萄糖醛酸代謝物，且其碎片離子m/z193.086 7、178.063 6與W5相同，因此推測W3為4-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-丁-2-酮葡萄糖醛酸。

W1準分子離子峰[M-H]-m/z371.132 0，推測分子式為C17H23O9，比W3準分子離子峰多2 u，推測W1為W3氫化代謝物。W1的二級質(zhì)譜碎片m/z195.101 9[M-H-GluA]-證實存在葡萄糖醛酸，且W1準分子離子峰、碎片離子m/z195.101 9、180.078 3比W3準分子離子峰、碎片離子m/z193.086 7、178.063 6均多2 u，表明W1發(fā)生了氫化，因此推測W1為4-(3-羥丁基)-2-甲氧基苯酚葡萄糖醛酸。W2準分子離子峰[M-H]-m/z275.059 6，推測分子式為C11H15O6S，比W5準分子離子峰多2 u，推測W2為W5氫化代謝物，其二級碎片離子m/z195.101 9[M-H-SO3]-證實結(jié)構中含有硫酸，碎片離子m/z195.101 9、180.078 6與W1相同，因此推測W2為4-(3-羥丁基)-2-甲氧基苯酚硫酸酯。

W4準分子離子峰[M-H]-m/z243.032 7，推測分子式為C10H11O5S，比W5準分子離子峰少30 u，表明W4在結(jié)構上比W5少1個甲氧基。m/z243.032 7比碎片離子m/z163.076 0多80 u，證實W4中含有硫酸結(jié)構，而m/z119.048 9為m/z243.032 7失去1分子硫酸后，再失去1分子CO得到，因此推測該化合物為4-(4-羥苯基)-丁-2-酮硫酸酯。

W7保留時間為7.12 min，其準分子離子峰[M-H]-m/z409.094 2，推測分子式為C19H21O8S，與對照品BDMC相比多102 u(80+16+6)，推測W7可能為BDMC羥基化氫化硫酸酯化代謝物。碎片離子m/z329.137 5證實存在硫酸。碎片離子m/z149.060 1為m/z329.137 5從C4、C5處裂解后失去1分子羥基得到，表明W7中含有羥基，因此推測W7為羥基化六氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯。碎片離子m/z245.011 6、259.027 7表明羥基與硫酸化均位于羰基碳一側(cè)，m/z179.070 7為m/z259.027 7失去1分子硫酸得到。保留時間5.12 min處為W7烯醇式結(jié)構色譜峰。

W10準分子離子峰[M-H]-m/z291.102 6，推測分子式為C19H15O3，與對照品BDMC準分子離子峰相比少16 u，推測W10為BDMC去羥基化代謝物。利用ChemDraw軟件繪制BDMC去掉1分子羥基的結(jié)構，并根據(jù)姜黃素類化合物裂解規(guī)律[7-8]進行碎片裂解，發(fā)現(xiàn)得到的碎片離子與實際得到的碎片離子不符，推測W10為BDMC去羥基化的同分異構體。嘗試將C3、C4位置的雙鍵結(jié)構換成三鍵，并去掉C1、C2位置的雙鍵，再次進行裂解發(fā)現(xiàn)，準分子離子峰m/z291.102 6分別從C1和C2、C2和C4、C4和C5處斷裂得到m/z185.060 0、171.044 6、145.056 2。其中，m/z249.091 1為m/z291.102 6失去1分子CO后重排得到，因此推測W10為1,7-雙(4-羥基苯基)庚-1-烯-4-炔-3-酮，其質(zhì)譜裂解規(guī)律示于圖4。

圖3 W5二級質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律Fig.3 MS2 spectrum and proposed fragmention pathways of W5

圖4 W10二級質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律Fig.4 MS2 spectrum and proposed fragmental pathways of W10

同理，W12準分子離子峰[M-H]-m/z295.133 2，推測分子式為C19H19O3，與對照品BDMC準分子離子峰相比少12 u(16-4)，推測由BDMC失去1分子雙鍵氧和1分子雙鍵得到。利用ChemDraw軟件繪制BDMC去掉1分子雙鍵氧和1分子雙鍵的結(jié)構，并根據(jù)姜黃素類化合物的裂解規(guī)律[13-14]進行碎片裂解，推測W12為四氫雙去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物，其質(zhì)譜裂解規(guī)律示于圖5。

圖5 W12二級質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律Fig.5 MS2 spectrum and proposed fragmental pathways of W12

2.4 CUR、DMC、BDMC在大鼠體內(nèi)的代謝途徑

姜黃提取物中3種姜黃素類化合物在大鼠血漿、膽汁中的代謝途徑以母體藥物還原氫化后與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合為主；糞便中以母體藥物還原氫化、還原氫化后與硫酸結(jié)合為主；尿液中以母體藥物還原氫化、還原氫化后與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合為主。姜黃提取物中3種姜黃素類化合物在大鼠體內(nèi)可能的代謝途徑示于圖6。

2.5 討論

本研究在姜黃提取物中共鑒定出59個代謝產(chǎn)物，糞便中18個、尿液中39個、血漿中33個、膽汁中36個。其中，姜黃素代謝產(chǎn)物16個(血漿中8個、糞便中5個、尿液中11個、膽汁中8個)；去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物15個(血漿中8個、糞便中3個、尿液中10個、膽汁中9個)；雙去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物16個(血漿中11個、糞便中4個、尿液中12個、膽汁中13個)；無法歸屬的代謝產(chǎn)物12個(血漿、糞便、尿液、膽汁各6個)。

不同生物樣品中，姜黃提取物各代謝產(chǎn)物在種類和數(shù)量上存在交叉。研究發(fā)現(xiàn)，同時存在于血漿、尿液、膽汁3種生物樣品中的代謝物最多，有14個(B1、B2、B6、B8、B9、B14、C2、C5、D2、D5、D8、W2、W4、W5)，為六氫或八氫原型藥物的葡萄糖醛酸或硫酸結(jié)合物、六氫或八氫原型藥物的葡萄醛酸和硫酸共同結(jié)合物；同時存在于糞便、尿液和膽汁生物樣品中的代謝物有3個，分別為C11(四氫雙去甲氧基姜黃素硫酸)、D14(去甲氧基姜黃素)、W7(六氫羥基化雙去甲氧基姜黃素硫酸酯)。糞便與尿液共同代謝產(chǎn)物有8個(B15、B16、C14、C15、C16、D13、W10、W12)，為一相代謝物和原型藥物；血漿與尿液共同代謝產(chǎn)物有4個(B11、C9、C12、D12)，主要為原型藥物葡萄糖醛酸或硫酸酯結(jié)合物；血漿與膽汁共同代謝產(chǎn)物有4個(B5、B13、C6、D6)，主要為四氫原型藥物的葡萄糖醛酸和硫酸共同結(jié)合物；尿液與膽汁生物樣品中共同代謝產(chǎn)物有3個(B7、C4、D1)，為八氫原型藥物的葡萄糖醛酸結(jié)合物或葡萄糖醛酸和硫酸共同結(jié)合物；4種生物樣品中均可發(fā)現(xiàn)代謝物B4、B10、C8、D4，為八氫或六氫原型藥物的硫酸酯結(jié)合物。此外，D3、D11、C3、B3、B12等二氫化原型藥物的葡萄糖醛酸結(jié)合物或葡萄糖醛酸和硫酸共同結(jié)合物僅在膽汁中發(fā)現(xiàn)。

本研究未對W1～W12進行歸屬，是因為W1～W5化合物結(jié)構較小，無法判斷是姜黃提取物中哪種成分的代謝產(chǎn)物；而W8、W9既可能是去甲氧基姜黃素去甲基化代謝產(chǎn)物，也可能是雙去甲氧基姜黃素羥基化代謝物；W10～W12既可能是雙去甲氧基姜黃素代謝物，也可能是姜黃提取物中其他姜黃素類化合物以原型形式排出體外；W7作為W8硫酸酯化代謝物同樣無法進行歸屬。另外，由于3種姜黃素類化合物均可能產(chǎn)生W6，因此本研究并未將W6歸屬為姜黃素代謝產(chǎn)物[19]。

與文獻[6,8-11]對比，本研究在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了16個新的代謝產(chǎn)物(B3、B7、B8、B11～B13、C3、D3、D5、D8、D10、W1、W2、W4、W5、W7、W10)、4個已知代謝物(B6、W3、W11、W12)。但未鑒定出文獻[11](大鼠灌胃給予姜黃素類化合物)在大鼠糞便和尿液中分離出的六氫姜黃素、六氫雙去甲氧基姜黃素、八氫姜黃素、八氫雙去甲氧基姜黃素、1,5-環(huán)氧-3-羰基-1,7-雙(4-羥基苯基)-4,6-庚二烯、八氫姜黃素二去甲基化二去羥基化代謝物、八氫雙去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物；未鑒定出文獻[10](大鼠灌胃給予去甲氧基姜黃素單體)在大鼠糞便和尿液中分離出的5-去羥基二氫去甲氧基姜黃素、六氫去甲氧基姜黃素甲基化代謝物、六氫去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物、八氫去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物，這可能是因為上述代謝產(chǎn)物排出體外需要的時間較長(收集糞便和尿液時間為48 h)，而本研究僅收集了0～12 h的糞便和尿液；未鑒定出文獻[6,9](大鼠灌胃給予姜黃素單體)在大鼠血漿中分離出的六氫姜黃素[6,9]、八氫姜黃素[6]、4-(3-羥丙基-1-烯基)-2甲氧基苯酚[6]、4-(3-羥丙基)-2-甲氧基苯酚[6]、1-羥基-4-(4-羥基-3-甲基苯基)-3-烯-2-酮[6]、二氫姜黃素葡萄糖醛酸[9]，這可能是因為姜黃提取物中的其他成分會促進姜黃素在大鼠體內(nèi)的代謝，加快了一相代謝物向二相代謝物的轉(zhuǎn)變；未鑒定出文獻[8](大鼠分別灌胃給予姜黃素納米制劑、去甲氧基姜黃素納米制劑、雙去甲氧基姜黃素納米制劑)在大鼠體內(nèi)分離出的去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯、雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯、六氫去甲氧基姜黃素硫酸酯、二氫雙去甲氧基姜黃素，這可能是因為本研究中去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素的給藥劑量比文獻低。

3 結(jié)論

本研究共鑒定出59個大鼠血漿、糞便、尿液、膽汁中的姜黃提取物代謝產(chǎn)物，其中16個新的代謝產(chǎn)物，糞便、血漿中新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物各2個，尿液中新發(fā)現(xiàn)1個代謝產(chǎn)物。研究表明，姜黃素類化合物原型成分及一相代謝產(chǎn)物主要存在于糞便、尿液中，二相代謝產(chǎn)物主要存在于血漿、膽汁中。本研究對去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物進行了補充，可為后續(xù)活性代謝物的篩選提供依據(jù)。