趙明月，侯玉珠，劉 鑫，王 洋，孫開(kāi)菊，龐 博，劉淑瑩，李 丹，蘇 蕊,3

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)無(wú)機(jī)合成與制備化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第二的癌癥，在女性癌癥患者中發(fā)病率居首位[1]。目前，在乳腺癌的臨床治療中采用手術(shù)輔以化療的方式，常用的治療藥物有阿霉素(adriamycin, ADM)，但由于阿霉素易產(chǎn)生耐藥性，成為乳腺癌化療中難以解決的難題[2-4]。枸櫞酸他莫昔芬是治療女性復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌的常用西藥，缺點(diǎn)是會(huì)對(duì)生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，輕者月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)，重者導(dǎo)致內(nèi)膜息肉和內(nèi)膜癌，且長(zhǎng)時(shí)間(17個(gè)月以上)大量服用會(huì)出現(xiàn)視網(wǎng)膜病或角膜混濁[5-8]。而其他西藥，如依西美坦(對(duì)胎兒有影響[9]、肝功能異常[10])、氯氧喹(擾亂血液系統(tǒng)、肝功能異常[11])、來(lái)曲唑(對(duì)胎兒有影響[12])和曲妥珠單抗(具有心肌毒性[13]、肺毒性[14])對(duì)人體均會(huì)產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)。因此，尋找毒性小、耐藥性小、靶向性強(qiáng)、有效性高的藥物是臨床上亟需解決的問(wèn)題。

中藥具有療而不傷、固本培元的優(yōu)勢(shì)[15]。研究表明，從不同中藥中提取獲得的柴胡皂苷[16-17]、姜黃素[18]、小檗堿[19]、青蒿素[20]、人參皂甙[21]等有效成分具有抗癌活性。中藥中的抗癌活性成分對(duì)乳腺癌腫瘤微環(huán)境有直接的細(xì)胞毒性作用，對(duì)乳腺癌腫瘤免疫具有間接的調(diào)節(jié)作用，能夠明顯改善化療效果[22-23]。Wang等[24]研究表明，甘草次酸能夠通過(guò)損害p38 MAPK-AP1信號(hào)軸有效抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移；Gunjan等[25]認(rèn)為18β-甘草次酸可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/FOXO3a/Bim通路誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡；Sun等[26]證實(shí)了柴胡皂苷D(SsD)可以在較低的藥物濃度下選擇性地抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng), 并有望成為安全、有效、經(jīng)濟(jì)的抗癌藥物。

柴胡皂苷是柴胡中具有代表性的生物活性成分，是很多抗病毒、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥物的有效成分[27]。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)柴胡提取物SsD進(jìn)行研究，證明SsD是柴胡中具有顯著藥用活性的三萜皂苷[28]，具有抗癌、調(diào)節(jié)免疫[29]、抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖[30]等作用，但是會(huì)誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞線粒體凋亡，激活細(xì)胞凋亡蛋白酶，進(jìn)而導(dǎo)致肝毒性[31]。由于乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展與代謝物的改變密切相關(guān)，在其惡性轉(zhuǎn)化、治療過(guò)程中，乳腺癌細(xì)胞的代謝組發(fā)生了一系列重組[32]，會(huì)發(fā)生糖代謝[33]、氨基酸代謝[34]、脂質(zhì)代謝[35]與核苷酸代謝[36]的紊亂。雖然SsD的藥用活性已有報(bào)道[30,37]，但其在乳腺癌治療過(guò)程中機(jī)體所產(chǎn)生的代謝變化尚不明確。

本文擬構(gòu)建乳腺癌小鼠動(dòng)物模型，設(shè)置健康組、對(duì)照組和給藥組，采用不同劑量SsD對(duì)其進(jìn)行給藥治療，并利用超高效液相色譜-串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Orbitrap MS)對(duì)3個(gè)組別不同給藥天數(shù)后的小鼠血清中的差異代謝物進(jìn)行篩查，并對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，旨從代謝組學(xué)角度研究小分子代謝物的變化，闡述藥物的療效及對(duì)機(jī)體的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；單通道數(shù)字移液器：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；Vortex Mixer QL-866渦旋振蕩器：上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；D-37520 Osterode離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；氮吹儀：上海鑫翁科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

SsD標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：20874-52-6)：上海源葉生物公司產(chǎn)品；氮?dú)?99.99%)：長(zhǎng)春巨洋氣體有限責(zé)任公司產(chǎn)品；甲醇、異丙醇、乙腈：HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher化學(xué)公司產(chǎn)品；超純水：采用上海和泰儀器有限公司超純水裝置(18.25 MΩ·cm)制備；Balb-c小鼠(SPF級(jí))：購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司；吐溫-20：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SsD腹腔注射液的配制 在20.00 mg SsD標(biāo)準(zhǔn)品中加入含1%吐溫-20的生理鹽水，定容至5.00 mL，得到50 μmol/L SsD貯備液，于4 ℃儲(chǔ)存。取適當(dāng)體積儲(chǔ)備液，稀釋獲得2.00 mg/kg(2.5 μmol/L)和0.4 mg/kg(0.5 μmol/L)的SsD腹腔注射液。

1.2.2血清提取 采用蛋白沉淀法提取小鼠血清。將取出的全血置于EP管內(nèi)，4 ℃放置1 h后，以4 339 r/min離心15 min，獲得血清樣本，保存于-80 ℃。質(zhì)譜檢測(cè)前對(duì)血清樣本進(jìn)行預(yù)處理，取一定量的血清于EP管內(nèi)，加入3倍血清體積的甲醇，渦旋30 s，隨后以11 134 r/min離心15 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?；加?.5倍血清體積的超純水，渦旋15 s，過(guò)0.22 μm 水相濾膜，獲得待分析樣品。

1.2.3乳腺癌小鼠模型的構(gòu)建 選擇26只Balb-c小鼠，置于12 h晝夜更替的動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由進(jìn)食、飲水。將其分為健康組、對(duì)照組和給藥組(高(2.0 mg/kg SsD)、低(0.4 mg/kg SsD)劑量組)，皮下注射4T1細(xì)胞，在腫瘤約100 mm3時(shí)完成構(gòu)建乳腺癌腫瘤模型。對(duì)乳腺癌模型小鼠進(jìn)行給藥治療，每隔1天腹腔注射給藥，每次注射200 μL SsD，連續(xù)給藥2周。在實(shí)驗(yàn)期間，記錄高、低劑量組體重、腫瘤大小以及死亡情況。30天后進(jìn)行安樂(lè)死，收集肝心脾肺腎和腫瘤組織。

1.2.4血樣采集 分別在給藥0、3、6、9、12、15、21和30天，用毛細(xì)玻璃管從眼眶靜脈叢采血，處理后進(jìn)行UPLC-Orbitrap MS測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 Thermo Accucore C18色譜柱(100 mm×2.1 mm ×1.9 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～1 min(10%B)，1～8 min(10%～65%B)，8～10 min(65%B)，10～17 min(65%～85%B)，17～18 min(85%～100%B)，18～21 min(100%B)，21～26 min(100%～10%B)；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件 正離子采集模式；Full-scan掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z70～1 000；分辨率70 000；自動(dòng)增益控制(AGC)：1×106；鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?，流速分別為8.4和12.1 L/min；毛細(xì)管溫度300 ℃；噴霧電壓3.5 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 非靶向代謝組學(xué)中靶目標(biāo)代謝物離子的篩查

采用UPLC-Orbitrap MS對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行全掃描，獲得高分辨代謝物離子的質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，隨后對(duì)從樣品中提取的6 766個(gè)離子進(jìn)行全掃描的非靶向分析，工作流程示于圖1。

圖1 UPLC-Orbitrap MS 非靶向代謝組學(xué)工作流程圖Fig.1 Workflow of the UPLC-Orbitrap MS based untargeted metabolomics method

經(jīng)過(guò)“80%規(guī)則”[38]處理后保留了6 427個(gè)離子，對(duì)所選離子進(jìn)一步篩選合并，以減少冗余離子，最后確定5 835個(gè)離子作為靶離子。給藥21天后，對(duì)照組和高、低劑量給藥組的總離子流圖示于圖2，所得代謝產(chǎn)物離子峰形較好，分離度較高，離子數(shù)量豐富。此外，為考察該方法的準(zhǔn)確性和精密度，對(duì)保留離子峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果示于圖3。在正離子模式下，對(duì)提取離子的峰面積進(jìn)行積分，43.2%代謝產(chǎn)物離子的峰面積RSD為0%～5%；29.3%代謝產(chǎn)物離子的峰面積RSD為5%～10%；16.1%代謝產(chǎn)物離子的峰面積RSD為10%～15%；8.0%代謝產(chǎn)物離子的峰面積RSD為15%～20%。共計(jì)96.6%的離子峰面積RSD(n=6)小于20%，表明本方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

圖2 連續(xù)給藥21天后的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms after 21 days of continuous administration

圖3 血清樣本中代謝物離子的RSD分布Fig.3 RSD distribution of all metabolites in the serum samples

2.2 柴胡皂苷D的藥效作用評(píng)價(jià)

對(duì)小鼠連續(xù)治療30天后安樂(lè)死取腫瘤組織進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組無(wú)變化；低劑量治療組小鼠的腫瘤體積小于對(duì)照組，為對(duì)照組體積的3/5；高劑量治療組的腫瘤體積顯著減小，為對(duì)照組體積的1/10。此外，對(duì)小鼠進(jìn)行了生存期實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示于圖4?？梢?jiàn)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束(30天)時(shí)，采用低劑量SsD治療的小鼠顯示了60%的存活率，高劑量治療組可以達(dá)到80%的存活率，表明SsD對(duì)乳腺癌腫瘤具有明顯的治療作用，能夠提高小鼠的存活率。

圖4 對(duì)照組和給藥組小鼠的生存期圖Fig.4 Survival curves of mice in control group andadministration groups

2.3 小鼠血清內(nèi)代謝物變化研究及治療效果判斷的多變量分析

為排除干擾，在質(zhì)譜數(shù)據(jù)的多變量判別分析之前做以下處理：1) 將SsD的準(zhǔn)分子離子m/z781.476 4[M+H]+及其產(chǎn)生的二聚體離子以及加合產(chǎn)物離子(如m/z803.458 5[M+Na]+)排除在待分析統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)集之外。2) 經(jīng)過(guò)單因素方差分析及PLS-DA分析，只有當(dāng)代謝物特征p值小于0.05，VIP>1，才可用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，所篩查的代謝物特征離子信息需滿足在預(yù)設(shè)的3個(gè)組別的80%以上樣品中能夠被有效提取到，才能加入訓(xùn)練集中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。最終獲得的數(shù)據(jù)集包含所篩查的內(nèi)源性代謝物離子的保留時(shí)間、離子形式及所對(duì)應(yīng)化合物的分子式、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)等信息。在將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover軟件之前，將質(zhì)量誤差設(shè)為≤10×10-6，保留時(shí)間偏差為±0.25 min。

將篩查的5 835個(gè)靶離子信息導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)軟件的數(shù)據(jù)集中，使用非監(jiān)督PCA和監(jiān)督PLS-DA進(jìn)行多元模式識(shí)別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖5。可知，在PCA分?jǐn)?shù)圖中，給藥治療0天、3天后，對(duì)照組和治療組(高、低劑量)無(wú)法達(dá)到明確區(qū)分；給藥治療9天后，對(duì)照組和低劑量治療組無(wú)法明顯區(qū)分，但與高劑量組可以清晰判別；給藥治療15天后，3個(gè)組別可以基本判別；給藥治療21天后，能夠顯著將3個(gè)組別區(qū)分開(kāi)。

注：a.0天；b.3天；c.9天；d.15天；e.21天圖5 對(duì)照組、低劑量和高劑量給藥組的PCA分?jǐn)?shù)圖Fig.5 PCA score plots of mice with control group, SsD low concentration group and SsD high concentration group

采用監(jiān)督PLS-DA進(jìn)行組別區(qū)分時(shí)，能夠較清晰地區(qū)分3個(gè)組別的血清樣本，示于圖6。PLS-DA模型中涉及2個(gè)重要參數(shù)：R2為解釋率，是原始數(shù)據(jù)信息百分比的平方；Q2為PLS-DA模型的預(yù)測(cè)能力。本研究通過(guò)擬合，在正離子模式中得到R2>0.82、Q2>0.71，表明實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的模型穩(wěn)定有效，不存在過(guò)度擬合的情況。因此，在接下來(lái)的組內(nèi)、組間特征離子篩查實(shí)驗(yàn)中，采用分離情況較好的PLD-DA模型中的VIP值(VIP>1)篩查特征代謝化合物離子，隨后將代謝物離子信息導(dǎo)入在線代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

注：a.0天；b.3天；c.9天；d.15天；e.21天圖6 對(duì)照組、低劑量和高劑量給藥組的PLS-DA分?jǐn)?shù)圖Fig.6 PLS-DA score plots of mice with control group, SsD low concentration group and SsD high concentration group

2.4 組內(nèi)、組間代謝物變化研究

本實(shí)驗(yàn)分別考察了同一組內(nèi)(對(duì)照組、低劑量和高劑量給藥組內(nèi))小鼠血清內(nèi)代謝物隨飼養(yǎng)天數(shù)的變化情況(橫向代謝物變化研究)，以及3個(gè)組別之間在給藥21天后小鼠血清內(nèi)代謝物的變化情況(縱向代謝物變化研究)，并研究橫縱向篩查所得化合物的重合性，以提高特征離子篩查的準(zhǔn)確度。

組內(nèi)代謝物變化結(jié)果表明，隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加，3個(gè)組別代謝物均有明顯變化；對(duì)照組中，小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中腫瘤體積隨天數(shù)增加明顯增大。將VIP值從大到小排序，篩查并列出VIP>1的前50個(gè)代謝物離子，示于圖7。以對(duì)照組篩查的代謝物為目標(biāo)，比對(duì)治療組篩查獲得的代謝物離子，結(jié)果列于表1。對(duì)照組篩查獲得12個(gè)目標(biāo)代謝物離子，且在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中趨勢(shì)變化顯著，其強(qiáng)度隨給藥時(shí)間變化的趨勢(shì)示于圖8，并對(duì)這12個(gè)化合物離子的生物學(xué)意義進(jìn)行考察。

圖7 對(duì)照組(a)、低劑量(b)和高劑量(c)給藥組的離子篩查 VIP 得分圖Fig.7 VIP score plots of the control group (a), SsD low concentration group (b), and SsD high concentration group (c)

研究表明，哌可酸(m/z130.086 98)在人體的含量與乳腺癌進(jìn)展速度呈正相關(guān)[39-40]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在對(duì)照組小鼠血漿中，m/z130.086 98離子強(qiáng)度隨癌癥患病時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加；在治療組中，隨著腹腔注射時(shí)間延長(zhǎng)，低劑量給藥組小鼠血清中m/z130.086 98強(qiáng)度升高，但離子強(qiáng)度增加趨勢(shì)較對(duì)照組下降；高劑量給藥組m/z130.086 98離子強(qiáng)度變化不大，表明SsD能夠抑制哌可酸的增加，示于圖8a。N-丙烯酰甘氨酸(m/z130.051 48)是在甘氨酸N-?；D(zhuǎn)移酶作用下的產(chǎn)物。Tian等[41]研究表明，甘氨酸N-?；D(zhuǎn)移酶的異常表達(dá)與乳腺癌進(jìn)程密切相關(guān)。圖8b表明，在對(duì)照組和治療組中，m/z130.051 48離子隨時(shí)間增加均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；給藥治療相同時(shí)間(9天、21天)，m/z130.051 48離子在給藥組中強(qiáng)度與對(duì)照組相比呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，表明了SsD具有干預(yù)治療作用。3-亞甲基吲哚(m/z130.066 68)是3-甲基吲哚的代謝產(chǎn)物之一，與生物體內(nèi)色氨酸代謝途經(jīng)相關(guān)[42]，但與乳腺癌進(jìn)展的關(guān)系尚不明確。從圖8c可知，在對(duì)照組與低劑量治療組中，隨癌癥患病天數(shù)增加，m/z130.066 68離子強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)；在高劑量治療組中，該離子強(qiáng)度明顯上升，表明SsD能夠促進(jìn)小鼠體內(nèi)血清中3-亞甲基吲哚含量增加。L-犬尿氨酸(m/z209.093 98)是一種免疫抑制代謝產(chǎn)物，可顯著抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，其含量變化與肝臟的代謝調(diào)節(jié)有關(guān)[43-44]。在SsD治療乳腺癌的過(guò)程中，即使是0.4 mg/kg SsD也可以使L-犬尿氨酸離子強(qiáng)度顯著下降，而在對(duì)照組中，隨小鼠癌癥患病天數(shù)增加，m/z209.093 98離子強(qiáng)度呈顯著上升趨勢(shì)，表明SsD對(duì)L-犬尿氨酸具有顯著的抑制作用，示于圖8d。苯乙胺(m/z122.097 08)具有抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的能力[45]。在對(duì)照組中，m/z122.097 08離子強(qiáng)度隨時(shí)間增長(zhǎng)而明顯降低；在低劑量組中，m/z122.097 08離子強(qiáng)度的降低趨勢(shì)有所減緩；在高劑量組中，苯乙胺水平變化不顯著，示于圖8e。給藥21天時(shí)，苯乙胺含量順序?yàn)椋焊邉┝拷M>低劑量組>對(duì)照組，表明SsD影響苯乙胺在小鼠體內(nèi)的生成和代謝，列于表2。由圖8f可知，對(duì)照組中DL-2-氨基辛酸(m/z160.133 58)離子強(qiáng)度隨時(shí)間變化呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)；在低劑量SsD給藥后，該離子上升趨勢(shì)變得緩慢，得到抑制；在高劑量給藥組中，該離子強(qiáng)度發(fā)生顯著下降，表明SsD可能通過(guò)抑制DL-2-氨基辛酸的合成來(lái)控制乳腺癌的發(fā)展。次黃嘌呤(m/z137.046 98)是一種潛在的有毒化合物，也是乳腺癌診斷的潛在生物標(biāo)志物[46]，圖8k表明，次黃嘌呤離子強(qiáng)度在3組中變化不大，但組間比較表明，其離子強(qiáng)度在高劑量組低于低劑量組和對(duì)照組。圖8g和圖8l表明，N(6)-甲基賴(lài)氨酸(m/z161.128 88)和己酰肉堿(m/z260.188 28)在對(duì)照組中呈下降趨勢(shì)，而在高、低劑量組變化不明顯，表明SsD可能對(duì)這3個(gè)代謝物離子產(chǎn)生影響，使之趨于正?；?。由圖8h和8j可知，吲哚乙醛(m/z160.076 38)和己酰甘氨酸(m/z174.112 68)的離子強(qiáng)度在3個(gè)組別中均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。3-甲基組胺(m/z126.103 58)能夠抑制淋巴細(xì)胞活化，在手術(shù)切除乳腺癌腫瘤后，尿液中3-甲基組胺含量會(huì)顯著下降[47-48]。由圖8i可知，給藥后，3-甲基組胺的增長(zhǎng)速率會(huì)明顯下降，表明SsD對(duì)其代謝途徑存在影響。

注：a.哌可酸；b.N-丙烯酰甘氨酸；c.3-亞甲基吲哚；d.L-犬尿氨酸；e.苯乙胺；f.DL-2-氨基辛酸；g.N(6)-甲基賴(lài)氨酸；h.吲哚乙醛；i.3-甲基組胺；j.己酰甘氨酸；k.次黃嘌呤；l.己酰肉堿圖8 組內(nèi)篩查獲得的12種代謝產(chǎn)物離子強(qiáng)度隨給藥時(shí)間變化的趨勢(shì)圖Fig.8 Intensity variations of potential 12 biomarkers obtained by intra-group screening

表2 給藥21天后，對(duì)照組、低劑量和高劑量給藥組組間小鼠血清的差異代謝物及其變化情況Table 2 Differential metabolite ions in serum screening of control group, SsD low concentration group and SsD high concentration group after 21 administration days

取給藥治療21天后的血清進(jìn)行代謝物變化篩查，研究組間代謝組學(xué)，對(duì)組間變化明顯的化合物進(jìn)行篩查和鑒定，所得信息列于表2?？芍?種化合物組間變化趨勢(shì)明顯。其中，在對(duì)照組、低劑量給藥組和高劑量給藥組中，m/z130.065 88離子強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，m/z122.097 08、130.086 88、209.093 98、160.076 48和144.103 48離子強(qiáng)度呈明顯下降趨勢(shì)，并且所獲得的5種離子和表2中篩查的離子重合，分別是3-亞甲基吲哚、苯乙胺、哌可酸、L-犬尿氨酸、吲哚乙醛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到交互驗(yàn)證，說(shuō)明代謝物離子篩查結(jié)果準(zhǔn)確可靠。5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶(m/z227.080 08)可在體內(nèi)產(chǎn)生，需經(jīng)過(guò)肝臟和腎臟的調(diào)節(jié)，存在于生物體的血液、尿液和糞便中。目前未見(jiàn)5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶與乳腺癌代謝相關(guān)的報(bào)道，其變化的產(chǎn)生可能與SsD相關(guān)，需要進(jìn)一步研究。脯氨酸甜菜堿(m/z144.103 48)對(duì)腎臟的滲透調(diào)節(jié)有積極作用，雖然之前未明確脯氨酸甜菜堿與乳腺癌進(jìn)展的關(guān)系，但其在食管鱗狀癌與甲狀腺癌中都發(fā)生了明顯變化[49-50]，推測(cè)小鼠血清中脯氨酸甜菜堿含量的變化可能與SsD藥物作用相關(guān)。

3 結(jié)論

本工作建立了一種代謝組學(xué)方法用于研究柴胡皂苷D對(duì)乳腺癌的治療作用及其治療過(guò)程中藥物作用對(duì)機(jī)體代謝物產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，SsD對(duì)乳腺癌小鼠具有較好的治療效果，能夠顯著提高小鼠的存活率。此外，隨著給藥次數(shù)和天數(shù)的增加，通過(guò)研究對(duì)照組、SsD低劑量和SsD高劑量給藥組小鼠血清中的代謝物離子變化，篩查與藥物影響作用較大的代謝物離子，并對(duì)其進(jìn)行定性分析和變化趨勢(shì)研究。SsD在治療乳腺癌過(guò)程中的代謝變化主要表現(xiàn)為氨基酸代謝與核苷酸代謝，這給藥物作用靶點(diǎn)和潛在腫瘤標(biāo)志物篩查研究提供了理論依據(jù)。