江涵 神應(yīng)強(qiáng) 陳謙明

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔黏膜病國(guó)家臨床重點(diǎn)?？浦袊?guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院口腔黏膜癌變與防治創(chuàng)新單元 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔黏膜病科 成都 610041

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常見的頭頸部惡性腫瘤，具有難治療、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，5年生存率低于50%。早診斷和早治療是提高OSCC患者生存率的關(guān)鍵[1-2]。早期就有研究揭示毒蕈堿（muscarinic，m）受體具有作為致癌基因的潛能[3-4]。近年來(lái)，圍繞m受體所展開的基礎(chǔ)研究也逐漸增多,但在不同類型的癌癥中，其作用機(jī)制尚無(wú)定論。因此，本研究利用癌癥基因圖譜（the cancer gene atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)及若干OSCC細(xì)胞系探討了m受體在OSCC 中的表達(dá)情況，并研究了m受體激動(dòng)劑卡巴膽堿在OSCC發(fā)生發(fā)展中的潛在作用及可能機(jī)制，以期為OSCC 的治療提供新靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人OSCC細(xì)胞系Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12以及人口腔上皮角質(zhì)細(xì)胞HOK（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，日本）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒（Applied Biosystems公司，美國(guó)）?？ò湍憠A試劑（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)）。細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒CCK8（Dojindo公司，日本）。Matrigel（BD公司，美國(guó)），Transwell小室（Corning公司，美國(guó)）。Yes相關(guān)蛋白（Yes related protein，YAP）-1抗體（Abcam公司，美國(guó)），p-YAP（S127）抗體（Cell signaling technology公司，美國(guó)）。

1.2 引物合成

根據(jù)既往文獻(xiàn)[5]確定目的基因及內(nèi)參基因序列及引物。引物序列如表1。

表1 m受體基因的引物序列Tab 1 Primer sequence of m receptor genes

1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)查詢

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)查詢m受體亞型基因在人體各種癌癥類型中及在頭頸部腫痛和正常組織中的差異表達(dá)水平，再進(jìn)一步查詢生存曲線分析各受體亞型基因?qū)︻A(yù)后的影響。

1.4 RT-qPCR

分別提取人OSCC細(xì)胞系Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12以及人口腔上皮膠質(zhì)細(xì)胞HOK的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄分別獲得各基因組DNA，用RT-qPCR擴(kuò)增chrm1、chrm3、chrm5，反應(yīng)體系為20 μL，SYBRTMSelect Master Mix預(yù)混液10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，無(wú)酶水7.2 μL。預(yù)變性95 ℃，2 min；變性95 ℃，15 s；退火65 ℃，15 s，延伸72 ℃，1 min共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將卡巴膽堿用滅菌水配制成100 mmol·L-1母液溶解后置于-80 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)處理組按不同濃度對(duì)母液稀釋，對(duì)照組加入等體積的稀釋液。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞系HSC4和HN12，分別消化離心后，再分別均勻鋪于96孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至約50%后，加入濃度梯度的卡巴膽堿（10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1）工作液，對(duì)照組換成等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后向每孔加入含有10%CCK8的200 μL工作液，孵育1.5 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

提前將Matrigel于4 ℃融化，按照1∶4的比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel，再將其均勻鋪于Transwell小室內(nèi)膜上，置于37 ℃孵箱中1 h 使Matrigel凝固。將生長(zhǎng)良好的OSCC細(xì)胞系HSC4和HN12消化離心，用無(wú)血清的培養(yǎng)基將懸液調(diào)整為每毫升5×105個(gè)備用。取出24孔板，先將含有濃度為1 μmol·L-1的卡巴膽堿無(wú)血清培養(yǎng)基500 μL加入24孔板，再將小室置于孔板中，向每個(gè)小室內(nèi)各加入上述處理好的細(xì)胞懸液200 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，結(jié)晶紫染色后漂洗除去多余染料，將小室的膜裁剪下來(lái)封片后置于顯微鏡下觀察。采集隨機(jī)選取的4個(gè)區(qū)域的固定細(xì)胞圖像，統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卡巴膽堿對(duì)OSCC細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響。將生長(zhǎng)良好的OSCC細(xì)胞系HN12的細(xì)胞懸液稀釋成每毫升1×104個(gè)加入4孔腔室載玻片中，每孔0.5 mL。待細(xì)胞貼壁后，換成含有卡巴膽堿（工作濃度為1 μmol·L-1）的培養(yǎng)基處理24 h后，將培養(yǎng)基棄去，經(jīng)固定、透膜及封閉后加入YAP1一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入熒光二抗室溫孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，每次15 min，滴加少許4’，6-二脒基-2-苯基吲哚蓋上蓋玻片于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)

通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)卡巴膽堿處理后Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集經(jīng)卡巴膽堿（工作濃度為1 μmol·L-1）處理2 h的OSCC細(xì)胞HN12的蛋白，使用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度后并加入5×上樣緩沖液混合煮沸10 min行凝膠電泳，結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯膜，用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉2 h后，根據(jù)相應(yīng)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小裁剪聚偏氟乙烯膜，分別加入對(duì)應(yīng)的YAP1，p-YAP（S127）一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，加入5 000×稀釋的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，用Western Blot顯影液顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析，多組之間的比較用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果分析

為整體了解m 受體基因（chrm1、chrm3、chrm5）在HNSC中的表達(dá)及與正常組織的表達(dá)差異性和對(duì)預(yù)后的影響，通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)果顯示如圖1A～C所示：在人體多種類型的癌癥中，與相應(yīng)正常組織相比，m受體基因均有表達(dá)差異。其中chrm1在HNSC中的表達(dá)降低，而chrm3、chrm5在HNSC中的表達(dá)升高。生存分析曲線結(jié)果顯示（圖1D～F）：chrm1和chrm5對(duì)生存期無(wú)影響，但是chrm3表達(dá)高的組別比正常組生存期低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示chrm3與預(yù)后相關(guān)。

圖1 m受體亞型基因的差異表達(dá)及生存分析Fig 1 The expression of m receptor subtype genes and survival analysis in TCGA database

2.2 RT-qPCR結(jié)果分析

通過(guò)RT-qPCR 反應(yīng)擴(kuò)增的目的基因chrm1、chrm3、chrm5片段，結(jié)果顯示：相對(duì)于人口腔上皮角質(zhì)細(xì)胞HOK，人OSCC 細(xì)胞Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12中，HN4和HN12細(xì)胞chrm3高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）（圖2B）。此外，chrm1和chrm5在腫瘤細(xì)胞中及正常 細(xì)胞中無(wú)明顯差異（圖2A、C）。

圖2 OSCC細(xì)胞株中m受體基因的表達(dá)水平Fig 2 The expression of m receptor subtype genes in OSCC cells

2.3 CCK8 細(xì)胞增殖與Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在卡巴膽堿作用細(xì)胞24 h后結(jié)果（圖3A）顯示：隨著卡巴膽堿濃度的增高，chrm3高表達(dá)的HN12細(xì)胞增殖活性逐漸增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而chrm3受體正常表達(dá)的HSC4細(xì)胞系的增殖則不受卡巴膽堿濃度的影響。為了進(jìn)一步檢測(cè)卡巴膽堿有無(wú)誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞侵襲的作用，仍然選取HSC4和HN12細(xì)胞，在卡巴膽堿工作濃度為1 μmol·L-1進(jìn)行Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3B～G所示：卡巴膽堿對(duì)m受體基因不同表達(dá)水平的細(xì)胞均有促進(jìn)侵襲的作用，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 卡巴膽堿在不同濃度下分別對(duì)HN12和HSC4細(xì)胞增殖活性及侵襲能力的影響Fig 3 Carbachol on the proliferation and invasion ability of HN12 and HSC-4 cells at different concentrations

2.4 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

為了分析卡巴膽堿是否通過(guò)影響Hippo信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲，采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)比加入卡巴膽堿后YAP的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位有無(wú)變化。結(jié)果如圖4所示：與對(duì)照組相比，卡巴膽堿處理后，HN12細(xì)胞中YAP的核轉(zhuǎn)位增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 卡巴膽堿對(duì)OSCC細(xì)胞內(nèi)YAP核轉(zhuǎn)位的影響Fig 4 The effect of Carbachol on the nuclear translocation of YAP in OSCC cells

2.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步分析上述結(jié)果中YAP和p-YAP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的變化情況，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)比在經(jīng)過(guò)卡巴膽堿處理后的OSCC細(xì)胞中YAP的p-YAP的表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示：與對(duì)照組相比，卡巴膽堿處理后，HN12細(xì)胞中的YAP和p-YAP具有差異表達(dá)，其中HN12細(xì)胞中YAP表達(dá)升高，而p-YAP（S127）表達(dá)降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖5 YAP和p-YAP經(jīng)過(guò)卡巴膽堿處理后在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig 5 The expression level of YAP and p-YAP in OSCC cells after treatment with Carbachol

3 討論

OSCC的治療雖在近幾年有所進(jìn)步，但是由于其預(yù)后差，尋找新的有效的治療靶點(diǎn)及藥物仍是亟待解決的問(wèn)題。神經(jīng)對(duì)組織生長(zhǎng)的依賴性最初是在19世紀(jì)的蠑螈肢體再生中被發(fā)現(xiàn)的。直至近年以來(lái)，研究者才逐漸關(guān)注周圍神經(jīng)對(duì)腫瘤的調(diào)控作用，并有一系列的研究在不同的惡性腫瘤中均有重要發(fā)現(xiàn)。其中，m受體作為周圍神經(jīng)所分泌的神經(jīng)遞質(zhì)的重要受體之一，其致癌潛能在前列腺癌中就有分析報(bào)道[4]。隨著研究的深入，m1受體被證實(shí)可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散[5]，并且通過(guò)使用這些受體的激動(dòng)劑也有了更進(jìn)一步的研究結(jié)果。有學(xué)者選擇m受體卡巴膽堿來(lái)進(jìn)行研究?？ò湍憠A又名氯化氨甲酸膽堿，為乙酰膽堿的類似物，是一種非選擇性膽堿能受體激動(dòng)劑，它可以通過(guò)與m受體相互作用而發(fā)揮相應(yīng)的生理生化作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用卡巴膽堿激活m受體后可通過(guò)FAK-YAP信號(hào)軸驅(qū)動(dòng)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。然而，在不同的腫瘤類型中，m受體及其亞型的作用卻不盡相同。研究[7-8]顯示，在胰腺導(dǎo)管腺癌和乳腺癌中，m1受體發(fā)揮了抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

本研究首先通過(guò)查詢TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)確定了與正常細(xì)胞相比，人OSCC細(xì)胞系中有毒蕈堿受體，特別是m3受體高表達(dá)。利用非選擇性m受體激動(dòng)劑卡巴膽堿進(jìn)行CCK8細(xì)胞增殖及Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)隨著卡巴膽堿濃度的增高，促進(jìn)增殖及侵襲的作用越強(qiáng)。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)YAP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，YAP蛋白作為Hippo信號(hào)通路中關(guān)鍵因子在調(diào)控癌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡中起著十分重要的作用[9]?；诖耍聹y(cè)m受體對(duì)此信號(hào)通路是否也會(huì)產(chǎn)生激活作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卡巴膽堿處理細(xì)胞后誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)YAP核轉(zhuǎn)位，具體來(lái)說(shuō)，鑒于S127位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)是調(diào)控YAP進(jìn)出核的主要因素[10]，YAP的升高和p-YAP（S127）的降低揭示原本在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布較多的YAP通過(guò)去磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和侵襲。然而，由于癌癥的發(fā)生過(guò)程不僅僅是單一的信號(hào)通路，m受體對(duì)OSCC的作用效果及其他作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，m受體亞型在OSCC細(xì)胞中呈明顯的差異表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)，使用m受體激動(dòng)劑卡巴膽堿可通過(guò)激活YAP從而誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞的增殖與侵襲。然而，各項(xiàng)基礎(chǔ)研究針對(duì)m受體對(duì)腫瘤的作用尚無(wú)定論，不同類型的腫瘤與m受體的相互作用并非一致，可能是由于配體與不同受體亞型結(jié)合后會(huì)激活不同的信號(hào)通路，導(dǎo)致不同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，未來(lái)的研究中需要結(jié)合腫瘤細(xì)胞的不同分子亞型來(lái)進(jìn)一步評(píng)估m(xù)受體的作用。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。