楊柳　況佳穎　任春梅　繆倩　陸芳　季英華　程兆榜

摘要： 葫蘆科作物在江蘇省蔬菜作物生產(chǎn)中具有重要的地位。為明確江蘇省葫蘆科作物上主要病毒的種類和分布，本研究于2019年6月-2020年11月在江蘇省內(nèi)7個地區(qū)的7 種葫蘆科作物上共采集了693份樣品，采用分子生物學(xué)方法對樣品進(jìn)行了檢測鑒定。結(jié)果共檢出9種病毒，以馬鈴薯Y病毒屬病毒最為常見，其中小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）在各地區(qū)的檢出率最高，在各個物種中的檢出率也較高。檢測結(jié)果還顯示，在各個地區(qū)的各種作物上普遍存在復(fù)合侵染現(xiàn)象，復(fù)合侵染中病毒種類最多達(dá)4種，ZYMV和西瓜花葉病毒（WMV）的復(fù)合侵染率最高。本研究結(jié)果有助于了解江蘇省內(nèi)葫蘆科作物病毒病的發(fā)生情況，為有效預(yù)防和控制病毒病害的發(fā)生和傳播提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 葫蘆科作物;植物病毒;種類鑒定;分布

中圖分類號： S642;S432.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0065-08

Abstract： Cucurbitaceae crops play an important role in the production of vegetables in Jiangsu province. To identify the types and distribution of major viruses on Cucurbitaceae crops， 693 samples were collected from seven species of Cucurbitaceae crops in seven locations in Jiangsu province from June 2019 to November 2020. The samples were detected and identified by molecular biological methods. The results showed that a total of nine kinds of viruses were detected， and viruses from Potyvirus were common. The detection rate of zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） was the highest in all regions and was high in all species. The results also showed that mixed virus infections were prevalent in different Cucurbitaceae crops of different locations， and up to four viruses were found in mixed infections in the tested samples， among which ZYMV and watermelon mosaic virus （WMV） co-infection showed the highest frequency. The results can help to understand the occurrence of virus diseases in Cucurbitaceae crops in Jiangsu province and provide a theoretical basis for effective prevention and control of viral diseases propagation.

Key words： Cucurbitaceae crops;plant virus;pathogen identification;distribution

葫蘆科作物廣泛分布于亞熱帶、熱帶和溫帶地區(qū)，具有重要的食用和藥用價值，在中國也是一種廣泛種植的重要經(jīng)濟(jì)作物。江蘇省是蔬菜種植大省，葫蘆科作物也有大面積分布。目前，江蘇省內(nèi)種植的葫蘆科作物主要有西瓜、甜瓜、黃瓜、絲瓜、冬瓜、南瓜、西葫蘆、瓠瓜、苦瓜等，其種植方式基本可分為露地栽培和設(shè)施栽培。

葫蘆科作物在栽培過程中經(jīng)常會受到病毒病的危害，隨著江蘇省內(nèi)葫蘆科作物種植規(guī)模的擴(kuò)大，病毒病的發(fā)生也愈加頻繁，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，往往會造成重大經(jīng)濟(jì)損失。侵染葫蘆科作物的病毒種類很多，根據(jù)古勤生等[1]的統(tǒng)計結(jié)果，葫蘆科作物病毒種類共計38個確定種，9個暫定種和1種類病毒[1]。隨著人們對葫蘆科病毒研究的不斷深入，根據(jù)林石明等[2]的統(tǒng)計結(jié)果，國內(nèi)外報道的為害葫蘆科作物的病毒種類已達(dá)到86種，這些病毒共涉及15個科、24個屬。國內(nèi)報道的經(jīng)常為害葫蘆科作物的病毒大約有10種，主要為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus， WMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus， PRSV）、南瓜蚜傳黃化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus， CABYV）、南瓜花葉病毒（Squash mosaic virus， SqMV）、甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒（Melon necrotic spot virus， MNSV）等[3-10]。這些病毒通常通過媒介昆蟲或者農(nóng)事操作等途徑傳播擴(kuò)散，它們一般會導(dǎo)致寄主發(fā)生系統(tǒng)性感染，并表現(xiàn)出各種典型癥狀，例如花葉、黃化、葉片褪綠、皺縮、畸形以及植株矮小或生長遲緩、果實(shí)畸形不可食用、頂端或者系統(tǒng)性壞死等。有些作物上還會發(fā)生病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，即多種病毒同時感染，而不只有某一種病毒侵染。

目前已有的報道大多針對特定作物上特定種類的病毒病，缺乏較為全面系統(tǒng)的調(diào)查鑒定。對江蘇省主要葫蘆科農(nóng)作物病毒病的發(fā)生情況開展較為全面的普查，對病毒種類進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，可以明確江蘇省葫蘆科作物上發(fā)生的主要病毒病種類、分布乃至擴(kuò)散趨勢，也有利于制定更具有針對性的、更為有效的病害預(yù)警和防控策略，從而促進(jìn)葫蘆科作物的生產(chǎn)和發(fā)展。本研究于2019年6月-2020年11月在江蘇省內(nèi)7個地點(diǎn)共采集了693份葫蘆科作物樣品，涵蓋了葫蘆科中較常種植的7種作物，對其進(jìn)行了檢測鑒定，共檢測出9種病毒，其中以馬鈴薯Y病毒屬病毒最為常見。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月至2020年11月，調(diào)查江蘇南京、蘇州、睢寧、豐縣、洪澤、東臺、姜堰共7個地區(qū)主要葫蘆科作物病害情況，在調(diào)查過程中對出現(xiàn)斑駁花葉、褪綠、黃化、皺縮、畸形、壞死等疑似病毒病癥狀的葫蘆科植物葉片進(jìn)行采集。

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照植物多糖多酚RNA提取試劑盒（上海浦迪生物科技有限公司產(chǎn)品）說明書上的步驟提取病葉樣品中的總RNA。提取后的總RNA經(jīng)NanoDrop超微量紫外分光光度計測定濃度和質(zhì)量后，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。反轉(zhuǎn)錄使用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品），取2 μl上述提取的RNA，按說明書步驟進(jìn)行操作，獲得的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR檢測

PCR反應(yīng)使用TaKaRa Ex Taq（寶生物工程有限公司產(chǎn)品），總體積為25.0 μl，其中2×Ex Taq Mix 12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄后的模板cDNA 1.0 μl，用ddH2O補(bǔ)足至25.0 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，退火30 s，退火溫度根據(jù)不同引物Tm值設(shè)定，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。根據(jù)已報道的葫蘆科作物常見病毒種類，設(shè)立的待檢病毒有CMV、TMV、PRSV、CABYV、SqMV、WMV、ZYMV、CGMMV、MNSV、甜菜偽黃化病毒（Beet pseudo-yellows virus， BPYV）、苦瓜黃脈病毒（Bitter gourd yellow vein virus， BGYVV）、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus， BYMV）、小西葫蘆綠斑駁病毒（Zucchini green mottle mosaic virus， ZGMMV）、小西葫蘆黃點(diǎn)病毒（Zucchini yellow fleck virus， ZYFV）、瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）、醬瓜綠斑駁花葉病毒（Kyuri green mottle mosaic virus， KGMMV）、甜瓜黃斑病毒（Melon yellow spot virus， MYSV）、黃瓜葉斑病毒（Cucumber leaf spot virus， CLSV）、黃瓜脈黃病毒（Cucumber vein yellowing virus， CVYV）、南瓜脈黃病毒（Squash vein yellowing virus， SqVYV）、瓜類黃矮化失調(diào)病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus， CYSDV）、絲瓜黃花葉病毒（Luffa yellow mosaic virus， LYMV）、甜瓜蚜傳黃化病毒（Melon aphid-borne yellows virus， MABYV）、絲瓜蚜傳黃化病毒（Suakwa aphid-borne yellows virus， SABYV）、摩洛哥西瓜花葉病毒（Moroccan watermelon mosaic virus， MWMV）、番木瓜花葉病毒（Papaya mosaic virus， PapMV）、南瓜曲葉病毒（Squash leaf curl virus， SLCV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV）、西瓜葉斑駁病毒（Watermelon leaf mottle virus， WLMV）、西瓜褪綠矮化病毒（Watermelon chlorotic stunt virus， WmCSV）、西瓜銀斑駁病毒（Watermelon silver mottle virus， WSMoV），共計31種病毒，檢測引物由南京擎科生物工程股份有限公司合成，具體序列及信息見表1。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行觀察分析。

BGYVV：苦瓜黃脈病毒;BPYV：甜菜偽黃化病毒; BYMV：菜豆黃花葉病毒; CABYV：南瓜蚜傳黃化病毒;CCYV：瓜類褪綠黃化病毒;CGMMV：黃瓜綠斑駁花葉病毒; CLSV：黃瓜葉斑病毒;CMV：黃瓜花葉病毒;CVYV：黃瓜脈黃病毒; CYSDV：瓜類黃矮化失調(diào)病毒;KGMMV：醬瓜綠斑駁花葉病毒;LYMV：絲瓜黃花葉病毒;MABYV：甜瓜蚜傳黃化病毒;MWMV：摩洛哥西瓜花葉病毒;MNSV：甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒;MYSV：甜瓜黃斑病毒; PapMV：番木瓜花葉病毒;PRSV：番木瓜環(huán)斑病毒;SABYV：絲瓜蚜傳黃化病毒;SLCV：南瓜曲葉病毒;SqMV：南瓜花葉病毒;SqVYV：南瓜脈黃病毒;TMV：煙草花葉病毒;TSWV：番茄斑萎病毒;WLMV：西瓜葉斑駁病毒;WmCSV：西瓜褪綠矮化病毒;WMV：西瓜花葉病毒;WSMoV：西瓜銀斑駁病毒;ZGMMV：小西葫蘆綠斑駁病毒;ZYFV：小西葫蘆黃點(diǎn)病毒;ZYMV：小西葫蘆黃花葉病毒。

1.4 PCR產(chǎn)物測序

將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物工程股份有限公司進(jìn)行純化、克隆和測序，測序結(jié)果采用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 江蘇葫蘆科作物病毒種類

2019年6月-2020年11月，共調(diào)查了江蘇省內(nèi)7個地區(qū)，涵蓋蘇北地區(qū)的睢寧、豐縣，蘇中地區(qū)的洪澤、東臺和姜堰，還有蘇南地區(qū)的南京和蘇州。在西瓜、黃瓜、甜瓜、絲瓜、南瓜、冬瓜、瓠瓜共7種作物上采集到具有斑駁花葉、皺縮畸形、黃化、壞死等疑似病毒病癥狀的葉片樣本共計693份。其中黃瓜樣本238份，西瓜樣本126份，南瓜樣本125份，絲瓜樣本79份，甜瓜樣本76份，冬瓜樣本47份，瓠瓜樣本2份（表2）。

對采集的樣品提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用31種常見的葫蘆科病毒引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，共檢出病毒9種，分別為ZYMV、WMV、CABYV、PRSV、CMV、CCYV、CGMMV、SqMV和TMV。其中ZYMV的檢出率明顯高于其他種類病毒，其次是WMV（表3）。TMV的檢出率最低，調(diào)查結(jié)果中僅有1個樣本中檢出TMV。

2.2 江蘇各地區(qū)葫蘆科作物病毒種類及分布

在采集的樣品中，睢寧地區(qū)檢出8種病毒，種類最多，分別為ZYMV、WMV、CABYV、PRSV、CCYV、CGMMV、CMV、TMV，未檢出SqMV。豐縣和蘇州均檢出7種病毒，其中豐縣檢出了較高頻率的CGMMV，而蘇州未檢出CGMMV，檢出4例SqMV。此外，南京地區(qū)檢出病毒6種，洪澤檢出4種，東臺檢出3種，姜堰檢出5種（圖1）。在蘇北睢寧和蘇南的蘇州采集的樣品較多，檢出的病毒種類也較多。洪澤、東臺和姜堰檢出的病毒種類相對較少，這可能與這2個地區(qū)的采樣量較少有關(guān)。在各個采樣地區(qū)均有檢出ZYMV和PRSV，其中ZYMV也是在各地區(qū)檢出率最高的病毒種類。WMV和CABYV分布也較為廣泛，除洪澤和東臺外的其他地區(qū)均有檢出。TMV僅在睢寧黃瓜樣本上檢出1例。

2.3 各寄主作物上病毒種類及分布

在所有采集的樣品中，從黃瓜樣品中檢出了8種病毒，分別為ZYMV、WMV、CABYV、PRSV、CCYV、CGMMV、CMV和TMV，檢出率最高的仍然是ZYMV，為42.86%，其次是WMV，檢出率為22.69%，TMV感染的僅有1例，未檢出SqMV（圖2）。南瓜和甜瓜的樣品數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于黃瓜，但檢出的病毒種類數(shù)僅次于黃瓜上檢出的病毒種類數(shù)，均為7種病毒。南瓜上未檢出TMV和CCYV，但檢出了SqMV，南瓜是所有采集樣品中唯一檢出SqMV的寄主物種。甜瓜上的病毒種類與黃瓜相比僅有TMV未檢出，但甜瓜上ZYMV的感染率高達(dá)88.16%，WMV的感染率也非常高，達(dá)61.84%。檢測結(jié)果顯示，所有采集樣品中除瓠瓜外，在田間均有ZYMV感染且感染率非常高，瓠瓜由于樣品量太少，暫未檢出ZYMV，但瓠瓜也是ZYMV的自然寄主之一。

2.4 復(fù)合侵染

在對江蘇各地的各種葫蘆科作物樣本進(jìn)行檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，多種病毒共同侵染同一植株的現(xiàn)象普遍存在，其中2種和3種病毒復(fù)合侵染的情況較多，最多可達(dá)到4種病毒復(fù)合侵染。復(fù)合侵染在所調(diào)查的江蘇各個地區(qū)均有發(fā)生，且在黃瓜、甜瓜、西瓜和南瓜上發(fā)生頻率較高。檢測結(jié)果（表4）顯示，ZYMV+WMV的復(fù)合侵染頻率最高，且主要發(fā)生在西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜上。

3 討論

近年來，隨著國內(nèi)蔬菜種植面積的擴(kuò)大和種植模式的變化，加之氣候影響，蔬菜上病毒病的發(fā)生越來越嚴(yán)重，對生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅[13-16]。雖然各地陸續(xù)已有對特定作物或特定病毒的發(fā)生情況的部分報道，但至今仍缺乏對葫蘆科作物病毒進(jìn)行系統(tǒng)全面的調(diào)查鑒定。江蘇省內(nèi)葫蘆科作物種植面積廣泛，本研究對省內(nèi)7個地區(qū)的7種葫蘆科作物上采集的693份樣品進(jìn)行了檢測，希望能夠通過較大面積的普查對江蘇省內(nèi)主要葫蘆科作物病毒病的發(fā)生與分布開展分析，從而為江蘇省葫蘆科作物病毒病的預(yù)防及綜合防控提供理論依據(jù)。

本研究共檢出9種病毒，其中ZYMV、WMV和PRSV的檢出頻率都很高。這3種病毒均為馬鈴薯Y病毒屬的成員，可感染絕大部分的葫蘆科作物，在中國甚至世界多個地區(qū)均有報道[17-19]。ZYMV、WMV和PRSV的共同特點(diǎn)是它們都會對植株造成系統(tǒng)性的感染和破壞，使葉片產(chǎn)生褪綠、黃化、花葉、畸形等癥狀，通常新葉癥狀比較明顯，后期會影響坐果，造成作物產(chǎn)量降低，或者果實(shí)畸形、出現(xiàn)斑駁從而失去商品價值。有研究結(jié)果表明，幼苗感染ZYMV會對作物造成95%～100%的產(chǎn)量損失，同時從受感染的植株上收獲的種子發(fā)芽率會大幅下降[20]。從傳播途徑的角度分析，除了ZYMV、WMV和PRSV，還有CABYV和CMV均可由蚜蟲進(jìn)行田間傳播。在對露地作物或者生長后期已敞棚的大棚作物進(jìn)行采樣時，常常看到蚜蟲，可能是造成這些病毒病發(fā)生概率較高的原因之一。因此加強(qiáng)對田間蚜蟲的防控或許可以有效控制這些病毒病的擴(kuò)散。

CCYV 是近幾年開始報道的一種新病毒，它是由煙粉虱以半持久性方式進(jìn)行特異性傳播的。被CCYV 侵染后植株一般表現(xiàn)為葉片的褪綠和黃化，尤其中下部葉片癥狀比較明顯，但葉脈仍為綠色[21]。據(jù)報道，CCYV引起的病毒病在華東和華南等部分地區(qū)有過大面積發(fā)生，且部分地區(qū)發(fā)病率高于50%[22]。本研究在南京、睢寧、蘇州、豐縣這些采樣比較多的地方均檢出了CCYV，受其感染和危害的作物主要集中在西瓜、黃瓜和甜瓜上。在蘇北豐縣部分采樣地點(diǎn)，不僅僅是大棚內(nèi)，戶外也飛著許多煙粉虱，并且據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶觀察，這些煙粉虱的大量發(fā)生還與當(dāng)?shù)靥鞖庥幸欢ㄏ嚓P(guān)性，推測這也和當(dāng)?shù)卦摬《緳z出率較高有關(guān)系。

CGMMV是一種典型的種傳病毒，會給被侵染植物造成花葉斑駁、植株矮小、果實(shí)失去價值、減產(chǎn)甚至絕收等危害[8]。它通過種子貿(mào)易等方式現(xiàn)已在世界各地區(qū)廣為流傳，中國的CGMMV就是從國外引進(jìn)種苗時流入的，后在全國多個省份均有檢出。CGMMV致病性強(qiáng)、危害嚴(yán)重且防治難度大，并且它感染后的黃瓜、西瓜、甜瓜、瓠瓜等作物的子一代種子均有較高的帶毒率，會導(dǎo)致二代植株也發(fā)生感染[23-25]。除了CGMMV外，有報道表明ZYMV也可通過種子傳播，在不同葫蘆科作物上的種傳率為0～18.9%[26]。種傳也是SqMV和CMV的重要傳播途徑之一。據(jù)報道，SqMV在甜瓜上的種傳率可達(dá)到2%[27]，CMV被檢測出在大豆、辣椒等作物上具有較高的種傳率[28-29]。這些病毒除CGMMV外既可以種傳也可以通過昆蟲媒介傳播，在生產(chǎn)中這些病毒病發(fā)生的最初源頭是引入的種子帶毒，還是田間雜草上存在病原，有待進(jìn)一步研究。但引種和育種過程中如果加強(qiáng)檢疫和防范，或者播種前進(jìn)行種子處理，都可以在一定程度上避免種傳病毒病的傳播和擴(kuò)散。

本研究所檢出的9種病毒中，除CCYV外，均可通過摩擦等機(jī)械損傷方式進(jìn)行傳播。葫蘆科作物在種植過程中經(jīng)常會有頻繁的農(nóng)事操作，比如嫁接、打岔、點(diǎn)花、打頂?shù)?，這些操作都會增加病毒感染的機(jī)會。如果砧木的種苗帶有CGMMV，可通過嫁接傳播，導(dǎo)致大批量的嫁接苗感染該病毒，從而造成西瓜生長晚期大規(guī)模減產(chǎn)甚至絕收。因此應(yīng)盡量避免在農(nóng)事操作中對植株產(chǎn)生創(chuàng)傷或者在必要的農(nóng)事操作環(huán)節(jié)（如嫁接）中增加消毒過程，這樣可以更大限度地阻止此類病毒的傳播。此外，對土壤進(jìn)行消毒處理、對田間病殘體和感病植株及時進(jìn)行處理也可以減少病毒傳播機(jī)會。

從本研究結(jié)果中還可以看出，同一植株被多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象十分普遍，其中2種或者3種病毒的復(fù)合侵染較為常見，根據(jù)調(diào)查檢測結(jié)果，這種現(xiàn)象在大多數(shù)采樣地區(qū)或者各種作物中均有出現(xiàn)，這就使得對病毒病防控的難度大大增加。出現(xiàn)這種情況可能和種植管理方式、病毒傳播方式等因素有一定的關(guān)系。例如有些昆蟲介體可能攜帶多種病毒，而根據(jù)本研究結(jié)果，可以通過機(jī)械傳播的病毒也占了大多數(shù)，這也有可能導(dǎo)致同一植株感染多種病毒。此外，是否某一種病毒的感染會提高其他病毒的感染概率也有待研究。

劉勇等[11]在全國范圍內(nèi)調(diào)查葫蘆科蔬菜作物的優(yōu)勢病毒依次為CMV、ZYMV、CGMMV和TMV;吳賀等[30]在蘇南地區(qū)72份葫蘆科蔬菜上共檢測出包括PMMoV、ZYMV、CCYV等在內(nèi)的9種病毒。本研究采樣范圍涵蓋江蘇省內(nèi)蘇北地區(qū)的睢寧、豐縣，蘇中地區(qū)的洪澤、東臺和姜堰，蘇南地區(qū)的南京和蘇州，這些地區(qū)也檢出了ZYMV、CCYV、CGMMV等主要病毒，但報道較多的CMV在本研究的采樣范圍內(nèi)檢出率較低。這可能和采樣的時間地點(diǎn)和隨機(jī)性有關(guān)系。此外，根據(jù)本研究結(jié)果，PRSV和CABYV在江蘇省內(nèi)的葫蘆科作物上也比較常見。

本研究也發(fā)現(xiàn)，有少部分樣品具有明顯癥狀，但并未檢出病毒，有可能這些樣品存在其他未涉及到的病毒感染，或者是由藥害肥害等其他原因造成的，還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

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