高學(xué)政 張配瑜 史雪瑩 賁玲芝 郭晴晴 劉海燕

(河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 石家莊 050024)

大菱鲆(Scophthalmus maximusLinnaeus)又名多寶魚， 屬鰈形目、菱鲆科、菱鲆屬， 是我國北方重要的工廠化海水養(yǎng)殖魚類。近年來隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展， 各種養(yǎng)殖環(huán)境脅迫導(dǎo)致魚體免疫力降低[1]， 大菱鲆養(yǎng)殖過程中如腸炎及腹水病等疾病頻發(fā)， 進(jìn)而帶來藥物使用問題， 2006年及2015年的2次大菱鲆藥物殘留事件也使得大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)遭受重創(chuàng)。因此， 亟需開發(fā)水產(chǎn)綠色飼料免疫增強劑以提高大菱鲆的免疫力。

中草藥富含多糖、脂肪、維生素和微量元素等多種動物機體所需要的營養(yǎng)成分， 及生物堿、皂苷、揮發(fā)油和色素等生物活性物質(zhì)[2]， 兼具營養(yǎng)與藥效的雙重作用， 具有無毒、無污染、無抗藥性、無殘留且經(jīng)濟(jì)易得等優(yōu)點， 能夠增強魚類的抗氧化與免疫力， 并通過提高攝食及改善腸道消化功能而促進(jìn)魚類生長[3，4]。復(fù)方中草藥經(jīng)合理配伍， 不同的活性成分能夠表現(xiàn)出特定的協(xié)同效應(yīng)， 比單一中草藥更有效[5]。目前關(guān)于飼料中添加復(fù)方中草藥對大菱鲆影響的研究報道較少， 且中草藥配方和添加方式各異效果也有差別[6—9]?！八木訙笔侨藚ⅰ仔g(shù)、茯苓和甘草四味基本中草藥為主的古方劑，其具有健脾益氣、治療胃腸功能紊亂和改善腸道黏膜免疫功能的藥理作用[10]。采用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法分析“四君子湯”的主要活性化學(xué)成分為人參皂甙(來自人參)、黃酮類和三萜化合物(來自甘草)[11]。本研究在傳統(tǒng)方劑“四君子湯”的基礎(chǔ)上， 篩選了9種中草藥進(jìn)行配伍， 旨在探討這種復(fù)方中草藥的不同劑量對大菱鲆幼魚生長性能、飼料利用及相關(guān)免疫指標(biāo)的影響， 為復(fù)方中草藥在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計與實驗飼料

本研究以9種中草藥原材料配伍成復(fù)方中草藥添加劑， 以水煎劑的形式在基礎(chǔ)飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%和4%的復(fù)方中草藥制成4種試驗飼料(對照組、1%組、2%組和4%組)。實驗所用中草藥購于河北省石家莊市康仁堂大藥房。復(fù)方中草藥由黨參(Codonopsis pilosulaNannf.)、白術(shù)(Atractylodes macrocephalaKoidz.)、茯苓(Poria cocosWolf.)、熟地黃(Rehmannia glutinosaLibosch.)、甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)、山楂(Crataegus pinnatifidaBunge.)、五倍子(Rhus chinensisMill.)、梔子(Gardenia jasminoidesEllis.)和生姜(Zingiber officinaleRoscoe.)9種中草藥組成， 配比為6∶5∶3∶3∶2∶2∶1∶1∶1。各中草藥原材料經(jīng)粉碎過40目篩， 按照方劑配伍置于不銹鋼鍋中逐級混勻， 加蒸餾水常溫浸泡30min， 煮沸50min， 將藥汁過濾倒出， 得到復(fù)方中草藥的水煎劑， 使5 mL藥液相當(dāng)于1 g中草藥?；A(chǔ)飼料以白魚粉和雞肉粉為主要蛋白源、α-淀粉為主要糖源配制而成， 飼料中蛋白質(zhì)水平與脂肪水平的設(shè)定參考Li等[12]和彭墨[13]的結(jié)果， 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。將中草藥水煎劑以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%和4%的比例添加到基礎(chǔ)飼料中形成4種試驗飼料， 混合均勻后制成直徑為3.0 mm的軟顆粒飼料， 存放于-20℃的冰箱中備用。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成Tab. 1 Formulation and proximate composition of the control diet

1.2 實驗用魚與養(yǎng)殖管理

實驗用大菱鲆購自天津盛億水產(chǎn)有限公司。正式實驗開始前進(jìn)行14d馴化， 使大菱鲆幼魚能適應(yīng)實驗養(yǎng)殖環(huán)境。馴化期間每天2次(8:00和18:00)飽食投喂基礎(chǔ)飼料。在馴化結(jié)束后， 禁食24h稱重并隨機分組。1140尾大小均勻， 體質(zhì)健康的大菱鲆幼魚[(22.01±0.01) g]隨機放入12個長方體玻璃纖維缸(長2 m、寬1.2 m和高1 m)， 每組3個重復(fù)， 每個重復(fù)95尾。

養(yǎng)殖用水為沙濾后的自然海水， 每日換水2次，每次換水1/2。光照采用自然光照加人工光照， 光周期為14L∶10D。每天8:00和18:00進(jìn)行飽食投喂。投喂30min后收集殘餌并烘干稱重， 以校正攝食量。試驗期間保證溶氧充足， 水質(zhì)條件如下: 溶氧大于6.0 mg/L， 鹽度25‰—28‰， 水溫15—18℃，氨氮濃度小于0.05 mg/L。正式養(yǎng)殖實驗期為40d。

1.3 樣品采集及測定

樣品采集在養(yǎng)殖試驗結(jié)束后， 對大菱鲆禁食24h， 稱量并記錄各缸中大菱鲆的總尾數(shù)和總體重。每缸隨機選取5尾魚， 稱重并測量體長， 裝入密封袋中于-20℃冰箱中保存， 用于進(jìn)行魚體營養(yǎng)組成的分析。每缸隨機取5尾魚進(jìn)行解剖， 取出完整內(nèi)臟團(tuán)稱重并記錄， 然后從內(nèi)臟團(tuán)中剝離肝臟、脾臟并稱重以計算臟體比、肝體比和脾指數(shù)等指標(biāo)。另外每缸再隨機取5尾魚， 用經(jīng)肝素鈉潤洗過的注射器尾靜脈取血， 3000×g離心15min， 獲得血漿用于非特異性免疫指標(biāo)測定。

樣品分析飼料與魚體營養(yǎng)組成: 飼料與魚體水分采用105℃直接干燥法(GB/T6435)測定。粗蛋白采用Foss全自動凱氏定氮儀Kjeltec8420測定。粗脂肪采用索氏提取法(GB/T6433)測定。粗灰分采用馬弗爐灼燒法(GB/T6438)測定。能量采用Parr6200全自動氧彈熱量儀測定。

非特異性免疫指標(biāo): 采用比濁法測定血漿溶菌酶(LZM)的活力; 利用免疫比濁法測定血漿免疫球蛋白(IgM)和補體C3的含量。以上指標(biāo)均采用自南京建成生物技術(shù)研究所提供試劑盒。

指標(biāo)計算增重率(WGR， %)=100 ×(終末體重-初始體重)/終末體重

特定生長率(SGR， %/d)=100×(ln終末體重-ln初始體重)/d

攝食率(FR， %/d)=100×攝食量/ [t×(終末體重+初始體重)/2]

飼料系數(shù)(FCR)=攝食量/(終末體重-初始體重)

存活率(SR， %)=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)

肥滿度(CF， g/cm3)=100×體重/體長3

臟體比(VSI)=100×內(nèi)臟團(tuán)重/體重

肝體比(HSI)=100×肝臟重/體重

脾指數(shù)(SI)=100×脾臟重/體重

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示， 采用Statistica10.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)， 若差異顯著時進(jìn)行Duncan’s多重比較， 顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中草藥對大菱鲆生長與飼料利用的影響

復(fù)方中草藥對大菱鲆幼魚的攝食率無顯著影響(P≥0.05)， 但顯著影響了大菱鲆的終末體重、增重率、特定生長率和飼料系數(shù)(P＜0.05)。1%組大菱鲆幼魚終末均重、增重率、特定生長率顯著高于其他各組(P＜0.05)， 而4%組的生長顯著低于其他各組(P＜0.05)。1%組的飼料系數(shù)顯著低于其他各組(P＜0.05)， 其他各組間無顯著差異(P≥0.05; 表2)。

表2 復(fù)方中草藥對大菱鲆生長與飼料利用的影響Tab. 2 The effect of Chinese herbal medicine on growth and feed utilization of turbot

2.2 復(fù)方中草藥對大菱鲆形體指標(biāo)的影響

結(jié)果表明復(fù)方中草藥對臟體比及肝體比沒有顯著影響， 但顯著影響了大菱鲆的肥滿度與脾指數(shù)，隨著添加水平的升高， 呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(表3)。1%組大菱鲆幼魚肥滿度顯著高于對照組和4%組(P＜0.05)， 1%組的脾指數(shù)顯著高于其他各組(P＜0.05)， 其余各組之間均無顯著差異(P≥0.05)。

表3 復(fù)方中草藥對大菱鲆形體指標(biāo)的影響Tab. 3 The effect of Chinese herbal medicine on physical indicators of turbot

2.3 復(fù)方中草藥對大菱鲆魚體營養(yǎng)組成的影響

由表4可知， 復(fù)方中草藥對大菱鲆幼魚的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和能量均無顯著影響(P≥0.05)。

表4 復(fù)方中草藥對大菱鲆魚體營養(yǎng)組成的影響Tab. 4 The effect of Chinese herbal medicine on body composition of turbot

2.4 復(fù)方中草藥對大菱鲆非特異性免疫指標(biāo)的影響

由表5可見， 復(fù)方中草藥顯著影響了大菱鲆幼魚血漿中補體C3和LZM的含量(P＜0.05)， 但對IgM含量沒有顯著影響(P≥0.05)。1%組大菱鲆幼魚血漿中補體C3和LZM含量顯著高于對照組(P＜0.05); 2%組大菱鲆幼魚血漿中LZM含量顯著高于對照組(P＜0.05)， 而補體C3含量與對照組無顯著性差異(P≥0.05)。

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥對大菱鲆攝食生長與飼料利用的影響

本研究所采用9種中草藥活性成分物質(zhì)包括多糖類、黃酮類、萜類化合物(單萜類、三萜類、倍半萜烯類、環(huán)烯醚萜)及各中草藥特有的活性化學(xué)成分(黨參-聚乙炔、多烯; 甘草-甘草甜素; 五倍子-沒食子酸， 生姜-姜辣素、姜酮酚， 梔子-藏紅花素)[15—23]。在本實驗條件下， 添加1%的復(fù)方中草藥可顯著提高大菱鲆的生長性能和飼料利用， 且此復(fù)方中草藥對攝食率無顯著影響， 因此， 本實驗復(fù)方中草藥可能是通過其所富含的多種營養(yǎng)成分來增強機體新陳代謝， 促進(jìn)蛋白質(zhì)合成來提高魚體飼料利用能力， 從而達(dá)到促進(jìn)生長性能的作用。前人研究表明中草藥活性成分可提高魚體消化酶活性[24]、調(diào)節(jié)腸道微生物[25]; 中草藥多酚類、黃酮類、多糖類和萜類化合物可提高魚體抗氧化能力和抗病力，從而間接促進(jìn)魚體生長[26]; 另外， 中草藥有效成分可促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成及刺激生長激素-胰島素樣生長因子軸1(GH-IGF-1軸)[27，28]。在克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)的研究中， 飼料中添加0.05%—0.30%的黨參多糖可顯著促進(jìn)其生長和飼料利用[29]。同樣， 在大頭亮鲃(Luciobarbus capito)的飼料中添加0.1%—0.4%熟地黃多糖顯著提高特定生長率和降低飼料系數(shù)[28]。使用0.8%—1.0%的干姜來飼喂南亞野鯪(Labeo rohita)幼魚60d， 可顯著提高特定生長率[30]。在水產(chǎn)動物中使用復(fù)方中草藥也可發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。由白術(shù)、茯苓和甘草等組成的復(fù)方中草藥也提高了大菱鲆的增重率， 且降低了飼料系數(shù)[9]。另外， 陳輝輝等[31]在飼料中添加甘草、山楂和茯苓等11味中草藥飼喂凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)， 降低了飼料系數(shù)， 提高了特定生長率和增重率。在花鱸(Lateolabrax japonicus)的研究中， 飼喂含有 2%復(fù)方中草藥的特定生長率和增重率卻顯著低于0.8%組[24]， 這與本實驗結(jié)果相一致， 本實驗中高劑量復(fù)方中草藥會導(dǎo)致特定生長率下降可能是由于中草藥導(dǎo)致大菱鲆過度免疫反應(yīng)， 從而消耗了更多的能量。

表 5 復(fù)方中草藥對大菱鲆非特異性免疫指標(biāo)的影響Tab. 5 The effect of Chinese herbal medicine on nonspecific immune indicators of turbot

復(fù)方中草藥的配方與添加形式會對中草藥的藥效發(fā)揮和適宜添加量產(chǎn)生影響[32]。單味藥或單一活性成分存在作用不全面的缺點， 復(fù)合方劑也不應(yīng)是2種以上中草藥的簡單疊加， 傳統(tǒng)方劑中某些固定配伍性的中草藥可能并不適用于水生動物， 制約著中草藥作為魚類飼料添加劑的發(fā)展。本實驗所用方劑是通過已知漁用中草藥的顯著療效與中藥學(xué)“君臣輔使”理論的結(jié)合， 適當(dāng)加減藥劑藥量進(jìn)行的合理配伍， 以達(dá)到促進(jìn)生長發(fā)育和提高免疫的目的。本實驗添加1%的復(fù)方中草藥顯著提高了大菱鲆的肥滿度， 2%組和4%組魚的肥滿度也有所提高， 這與中草藥促進(jìn)鯉、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的肥滿度升高的結(jié)果一致[33，34]， 肥滿度與魚類的營養(yǎng)狀況直接相關(guān)[35]， 也進(jìn)一步說明本實驗中1%的復(fù)方中草藥對大菱鲆的機體生理和營養(yǎng)狀況產(chǎn)生了良好效果。

3.2 復(fù)方中草藥對大菱鲆非特異性免疫的影響

非特異性免疫系統(tǒng)是魚類抵御病原侵襲的第一道防線。中草藥及其提取物含有多糖、黃酮類、皂苷、揮發(fā)油、多酚類、生物堿、萜類、凝集素和多種氨基酸等活性成分， 能夠刺激補體和溶菌酶等的活性和抗體反應(yīng)， 促進(jìn)吞噬細(xì)胞的功能，提高殺菌活性， 來對抗由細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等引起疾病[36]。以前研究發(fā)現(xiàn)， 黨參對大黃魚(Larimichthys croceaRichardson.)[37]、鯽[38]和仿刺參(Apostichopus japonicus)[39]， 含白術(shù)和山楂的復(fù)方對黃鱔(Monopterus albus)[40]， 茯苓對施氏鱘(Acipenser schrenckiBrandt.)[41]， 熟地黃和甘草對鯉[42，43]，五倍子對鳙(Aristichthys nobilis)[44]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[45]， 梔子對克氏原螯蝦(Procambarus clarkiaGirard.)[46]， 生姜對尖吻鱸(Lates calcariferBloch.)[47]和斑馬魚(Danio rerio)[48]等均顯示出提高免疫功能和增強抗炎抗菌能力的作用。復(fù)方中草藥經(jīng)合理配伍， 不同的活性成分能夠表現(xiàn)出特定的協(xié)同效應(yīng)， 可能比單一草藥更有效[5]。本研究中的復(fù)方采用了具有健脾益氣、清熱解毒、收濕斂瘡和抗炎殺菌等功效的中草藥， 結(jié)果表明其可顯著提高大菱鲆的補體C3和溶菌酶活性， 這也與李華等[7]和路晶晶等[9]的結(jié)果相似， 能夠提高大菱鲆免疫功能。

脾臟作為魚體內(nèi)重要的免疫器官， 其增殖和發(fā)育與魚類的免疫功能密切相關(guān)[49]。在草魚、羅非魚和黃顙魚的研究中發(fā)現(xiàn)， 中草藥可顯著促進(jìn)脾指數(shù)升高， 增強免疫力[50—52]。在本實驗中1%組大菱鲆的脾指數(shù)顯著提高， 另兩組也較對照組略有提高，說明本實驗中的復(fù)方中草藥有利于大菱鲆的脾臟發(fā)育， 具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

以前研究結(jié)果表明免疫增強劑對魚類免疫力的作用受給藥時間與添加劑量的綜合影響， 添加劑量與免疫增強作用之間并非總呈正相關(guān)[53，54]。羅非魚的研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加0.025%—0.2%劑量的苦參(Sophora flavescensAit.)提取物時， 羅非魚的非特異性免疫指標(biāo)在0.1%時的增強作用最大[55]。本試驗也表現(xiàn)出相似的結(jié)果， 添加2%和4%的高濃度組的免疫指標(biāo)均低于1%組， 說明過高濃度的復(fù)方中草藥對魚類的免疫功能反而有一定的抑制作用。此外， 在對凡納濱對蝦連續(xù)投喂復(fù)方中草藥21d后發(fā)現(xiàn)， 其消化酶指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)分別在7d和14d達(dá)到最高值， 表明復(fù)方中草藥的作用與投喂時間長短也有著直接聯(lián)系[56]。然而， 本研究僅在40d時分析了免疫指標(biāo)， 是否還存在更好的投喂時間和方式還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究中的復(fù)方中草藥合煎劑在飼喂大菱鲆40d后顯著提高了大菱鲆的特定生長率， 降低了飼料系數(shù)， 顯著提高了肥滿度和脾指數(shù)， 并通過提高大菱鲆血漿補體C3含量和溶菌酶活力增強了大菱鲆的非特異性免疫力。綜合分析， 本復(fù)方中草藥在大菱鲆配合飼料中的推薦添加量為1%。