余嬌嬌 劉 洪 張超雯 趙建剛 葉長鵬

(暨南大學(xué)水生生物研究中心， 廣東省教育廳富營養(yǎng)化和赤潮防治重點實驗室， 廣州 510632)

赤潮是近年來主要的海洋災(zāi)害之一， 赤潮的頻繁暴發(fā)， 對全球海洋生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響，同時引起了巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 并危害人類健康[1]。赤潮防治已成為全世界最為關(guān)注的研究課題之一[2]。傳統(tǒng)的赤潮防治方法如物理和化學(xué)方法均有一定的局限性， 并且存在二次污染的可能性。生物防治法則具有成本低和環(huán)境友好等特點， 在防治赤潮方面有巨大潛力和應(yīng)用前景[3]。

許多研究報道水生植物、微生物對赤潮微藻有良好的抑制作用[4—6]， 但都有利用規(guī)模和區(qū)域的限制。而大型藻類作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中資源豐富和環(huán)境友好的土著種， 具有較強(qiáng)的吸收氮磷營養(yǎng)鹽的能力[7，8]， 是治理赤潮的理想生物材料。大量研究表明大型海藻可以通過競爭和化感作用抑制赤潮微藻[8，9]。例如張善東等[10]研究了大型海藻龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)通過營養(yǎng)競爭抑制赤潮微藻的生長; 劉之威等[11]在海域規(guī)模培養(yǎng)龍須菜的研究同樣表明大型海藻可以降低海水富營養(yǎng)化程度、抑制有害藻華發(fā)生。南春容和董雙林[12]研究則表明即使在無營養(yǎng)競爭的情況下， 高密度的大型海藻孔石莼(Ulva pertusa)依然能抑制赤潮微藻的生長; 羅麗娜[13]研究的4種大型海藻均能化感抑制赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo); Ye等[14，15]、盧慧明[16]、余江等[17]的多個研究報道顯示龍須菜可以抑制多種赤潮微藻， 并在其中提取出化感物質(zhì)。此外， 還有大量研究報道了多種大型海藻對赤潮微藻的抑制作用， 如蜈蚣藻(Grateloupia filicina)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)[9]、滸苔(Enteromorpha prolifera)[18，19]和紫菜(Porphyra yazoensis)[20]。

裂片石莼(Ulva fasciata)是一種常見的大型海藻， 廣泛分布于我國沿海地區(qū)， 具有生長快速， 低成本、易于收集和環(huán)保的優(yōu)勢[21]， 一直被視為開發(fā)食品[22]、保健品[23]、飼料[24]和燃料[25]等重要海洋資源。同時， 裂片石莼還可以凈化水質(zhì)， 吸收重金屬元素[26]， 在降低近海岸及海產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)富營養(yǎng)化的同時， 減少有害水華的發(fā)生[27]; 裂片石莼對多種赤潮微藻有化感抑制作用， 從中分離出的一些化感物質(zhì)并已被證實對多種赤潮微藻有良好的抑制效果[28]， 是控制赤潮藻的潛在材料。赤潮異彎藻是一種廣溫廣鹽性赤潮藻， 在溫帶水域的夏、秋季生長最快。赤潮異彎藻能產(chǎn)生溶血性毒素，是引起魚類大量死亡的主要有害藻種之一[29]。裂片石莼具有強(qiáng)抑藻活性， 但已有研究主要側(cè)重于從表觀生長和基礎(chǔ)光合效率的角度觀察抑藻效果，裂片石莼對赤潮微藻光合作用結(jié)構(gòu)和功能抑制機(jī)制沒有詳細(xì)解析。因此本研究選取大型海藻裂片石莼和典型的赤潮微藻赤潮異彎藻作為研究對象。光合作用是赤潮藻生長的原初動力， 葉綠體是光合作用的發(fā)生場所， 為了更好地闡明大型海藻對微藻的抑制機(jī)理， 有必要對大型海藻介導(dǎo)下赤潮微藻的光合作用過程， 以及葉綠體相應(yīng)的微觀結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行更系統(tǒng)的研究。為此， 本文展開了大型海藻裂片石莼干粉(以下簡稱石莼藻粉)對赤潮異彎藻的光合抑制研究， 以期闡釋裂片石莼對赤潮異彎藻抑制的光合生理生物學(xué)機(jī)制， 為大型海藻的赤潮治理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究所采用的赤潮異彎藻源自暨南大學(xué)水生生物研究中心藻種室， 使用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)。調(diào)節(jié)培養(yǎng)液為鹽度30‰， pH8.0; 培養(yǎng)條件為溫度20℃， 光照強(qiáng)度70 μmol·photons/(m2·s)(白光)， 光照周期12h∶12h(L∶D)。大型海藻裂片石莼采自廣東省汕頭南澳海域， 低溫運(yùn)至實驗室后立即用經(jīng)0.22 μm濾膜過濾并滅菌的天然海水漂洗多次后， 置于室溫下風(fēng)干至恒重， 再研磨成粉， 收集經(jīng)80目絹篩過篩后的石莼藻粉， 常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

取初始密度為2.0×104cells/mL的赤潮異彎藻0.3 L放入規(guī)格為1 L的錐形瓶中， 再加入石莼藻粉。石莼藻粉裝入由100 μm篩絹制成， 并加入了適量玻璃珠(使藻粉沉入瓶底)的無菌縮口小袋中， 濃度梯度設(shè)置為0、0.6、1.2、2.4和4.8 g/L， 每個梯度設(shè)置3個平行。實驗培養(yǎng)條件為溫度20℃， 光照強(qiáng)度為70 μmol·photons/(m2·s)(白光)， 光照周期L∶D=12h∶12h。實驗周期為4d， 每天早上8點定時采集等體積藻液來測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 光合色素含量的測定

用甲醇提取法測定葉綠素a與類胡蘿卜素含量，根據(jù)Wellburn[30]的公式計算:

葉綠素a: Chl.a(μg/mL)=[16.29×(A665-A750)-8.54×(A652-A750)]×Va/Vb

類胡蘿卜素: Car (μg/mL)=7.6×[(A480-A750)-1.49×(A510-A750)]×Va/Vb

赤潮異彎藻生物量變化用葉綠素a含量來表征。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

葉綠素快速熒光動力學(xué)曲線由植物效率分析儀(PEA， Hansatech)測定。JIP指標(biāo)(JIP-test)測定是依據(jù)能量流動模型[31—33]， 各參數(shù)含義如表1。

表1 葉綠素快速熒光動力學(xué)參數(shù)及含義Tab. 1 Parameters derived from chlorophyll fluorescence transients and their meaning

1.5 細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的測定

利用透射電子顯微鏡(TEM)測定赤潮異彎藻葉綠體等微觀結(jié)構(gòu)變化。在實驗72h時， 取對照組和最高濃度處理組進(jìn)行透射電鏡觀察， 比較微觀結(jié)構(gòu)異同之處。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010進(jìn)行處理， 用SPSS作單因素方差分析，P＜0.05時為顯著差異。用Origin 9.0和Ai進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 對赤潮異彎藻光合色素的影響

赤潮異彎藻暴露于不同生物量石莼藻粉后， 隨著時間的延長， 石莼藻粉對微藻的生長產(chǎn)生了顯著抑制作用， 不同生物量梯度處理組下的赤潮異彎藻色素含量相較于同時期的對照組下降明顯， 且呈現(xiàn)出較強(qiáng)的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)(圖1)。2h時， 所有石莼藻粉處理組的赤潮異彎藻葉綠素(Chl.a)、類胡蘿卜素(Car)含量與對照組相比均無顯著差異; 而24h開始至實驗結(jié)束， 各濃度梯度處理組赤潮異彎藻的2種色素含量顯著低于對照組(P＜0.05); 在72h時， 0.6、1.2、2.4和4.8 g/L石莼藻粉處理組對赤潮異彎藻抑制率分別為19.6%、46.5%、71.4%和79.4%。石莼藻粉對赤潮異彎藻的生長抑制效果明顯。

圖1 裂片石莼藻粉對赤潮異彎藻葉綠素a和類胡蘿卜素含量的影響Fig. 1 Effects of dried U. fasciata on Chlorophyll a and carotenoid contents of H. akashiwo

2.2 對赤潮異彎藻葉綠素快速熒光動力學(xué)曲線的影響

石莼藻粉對赤潮異彎藻OJIP曲線的影響同樣有較強(qiáng)的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)(圖2)。2h時， 各個濃度處理組的I相、P相對于對照組就有了小幅度的下降; 72h時， 各個處理組OJIP曲線相對于對照組的下降幅度與石莼藻粉生物量呈正相關(guān)， 4個處理組中只有0.6 g/L處理組的OJIP曲線依然清晰可辨，1.2 g/L處理組OJIP相較平緩， 2.4和4.8 g/L處理組則近似一條直線。

圖2 裂片石莼藻粉對赤潮異彎藻OJIP曲線的影響Fig. 2 Effects of dried U. fasciata on Chlorophyll a fluorescence transients of H. akashiwo

2.3 對赤潮異彎藻PSⅡ能量流動比活性的影響

如圖3所示， 經(jīng)裂片石莼藻粉處理2h后， 各個處理組的赤潮異彎藻ABS/RC、TRo/RC值與對照組無顯著性差異， 而各處理組ETo/RC已經(jīng)顯著低于對照組。72h后， 2.4和4.8 g/L兩處理組的ABS/RC、TRo/RC值顯著高于對照組， 1.2、2.4和4.8 g/L三組的ETo/RC值顯著低于對照組; 4.8 g/L處理組的單位反應(yīng)中心吸收的能量ABS/RC和用于還原QA的能TRo/RC分別上升至對照組的15倍和1.5倍， 而電子傳遞的能量ETo/RC則下降了81.3%， 說明赤潮異彎藻的光反應(yīng)中心Ⅱ(PSⅡ)遭破壞， 并且電子傳遞效率下降。

圖3 裂片石莼藻粉對赤潮異彎藻比活性參數(shù)的影響Fig. 3 Effects of dried U. fasciata on specific energy fluxes per RC of H. akashiwo

2.4 對赤潮異彎藻PSⅡ能量分配比率的影響

石莼藻粉對赤潮異彎藻PSⅡ能量分配比率的影響同樣有一定的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)(圖4)。2h時， 各處理組的3種量子產(chǎn)額基本都顯著低于對照組。然而在72h時， 除0.6 g/L處理組相對于對照組沒有顯著變化， 其他3個處理組均顯著低于對照組。這可能是低生物量的石莼藻粉對赤潮異彎藻的影響有限， 對其抑制作用會隨著時間削弱。高生物量的石莼藻粉(4.8 g/L)使赤潮異彎藻最大光化學(xué)效率ψPo、電子傳遞所用的量子產(chǎn)額ψEo和QA下游能量占總能量的比率Ψo分別下降81.2%、91.7%和81.7%， 赤潮異彎藻光合效率下降， 并且電子傳遞阻斷于QA處。

圖4 裂片石莼藻粉對赤潮異彎藻能量分配比率的影響Fig. 4 Effects of dried U. fasciata on energy flux ratios of H.akashiwo

2.5 對赤潮異彎藻細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響

赤潮異彎藻， 無細(xì)胞壁， 細(xì)胞核一般較小。葉綠體7—15個， 有淀粉核， 無眼點、伸縮泡和黏液泡。對照組和處理組培養(yǎng)時間均為72h。

在對照組(圖5a)的赤潮異彎藻細(xì)胞中， 葉綠體(C)內(nèi)物質(zhì)豐富， 呈圓盤狀， 分布在細(xì)胞質(zhì)外側(cè)， 類囊體(Thy)片層排列整齊， 在每個葉綠體中都是沿著一個方向排列(圖5b)， 并且有靠近細(xì)胞外側(cè)分布密集而靠近細(xì)胞內(nèi)側(cè)分布松散的趨勢， 這樣的分布便于葉綠體吸收光能進(jìn)行光合作用， 類囊體片層部分位置垛疊密集， 形成類似高等植物的類囊體基粒結(jié)構(gòu)。而在處理組 (圖5c)細(xì)胞中， 葉綠體內(nèi)物質(zhì)稀疏， 分布散亂， 葉綠體外膜破裂， 類囊體分布沒有明確的趨向性， 排列也沒有方向性， 類囊體片層(圖5d)多處斷開， 許多葉綠體變得模糊， 膜系統(tǒng)融合、混成一團(tuán)。

在對照組(圖5a)中可以看到， 赤潮異彎藻細(xì)胞膜(Cm)完整， 整個細(xì)胞形態(tài)完整清晰， 細(xì)胞核(N)處于細(xì)胞中央， 核仁(Nc)明顯， 多個葉綠體(C)分布在細(xì)胞質(zhì)外圍， 線粒體內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成非常密集的內(nèi)脊。由于缺乏細(xì)胞壁的保護(hù)， 處理組(圖5c)的細(xì)胞受損非常明顯， 細(xì)胞膜破裂嚴(yán)重導(dǎo)致難以觀察、分辨出細(xì)胞膜的存在， 細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)散落雜亂， 線粒體變的腫脹， 外膜出現(xiàn)裂口， 內(nèi)脊減少、退化， 非常松散， 少數(shù)脊突結(jié)構(gòu)從外膜裂口散出。核膜有破裂，整個核形態(tài)較難識別， 核內(nèi)的核仁也難以分辨。

圖5 赤潮異彎藻細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig. 5 Changes in cell microstructure of H. akashiwo

3 討論

3.1 對赤潮異彎藻生長的影響

藻類光合色素含量是反映其光合效率的重要指標(biāo)， Tang 和 Gobler[34]的研究結(jié)果顯示， 1 g/L的石莼藻粉就能顯著抑制錐狀斯氏藻(Scippsiella trochoidea)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和海洋原甲藻的生長; 羅麗娜[13]研究發(fā)現(xiàn)， 1 g/L的裂片石莼、龍須菜和細(xì)基江蘺(Gracilaria tenuistipitata)藻粉都能顯著抑制赤潮異彎藻的生長， 并且1 g/L的石莼藻粉在48h時對赤潮異彎藻就有了53%的抑制率，比本研究的抑制率更強(qiáng)， 這可能是因本實驗赤潮異彎藻起始生物量與羅麗娜實驗不一致所致。在本研究中， 石莼藻粉同樣能有效抑制赤潮異彎藻的生長， 這與同類研究結(jié)果較一致[13—15]。

大型海藻可以通過化感作用抑制赤潮微藻的生長， 在不同處理方式下對赤潮微藻的影響效果不同， 例如Tang和 Gobler[34]的研究表明， 與新鮮的大藻相比， 等量的孔石莼藻粉對有害藻類的抑制效果相當(dāng)或更好; 羅麗娜[13]同樣發(fā)現(xiàn)3種大型海藻藻粉在實驗前期對赤潮異彎藻的抑制效果更好， 而在實驗后期鮮藻的抑制效果更好; 南春容和董雙林[12]研究發(fā)現(xiàn)即使在營養(yǎng)鹽充足情況下， 新鮮的石莼依然可以抑制赤潮微藻生長。這些研究結(jié)果說明大型海藻粉可能更快地釋放化感物質(zhì)抑制赤潮微藻的生長， 而新鮮的大藻則可能持續(xù)釋放化感物質(zhì)， 抑制赤潮微藻。不同溶液的大藻浸提物對赤潮微藻也有不同的抑制效果， 韓秀榮等[35]發(fā)現(xiàn)滸苔有機(jī)提取物抑藻效果強(qiáng)于水相提取物; 崔峰[19]同樣發(fā)現(xiàn)不同溶液的滸苔提取物抑藻效果不同， 對不同藻類抑制效果也有差別。盧慧明[16]在龍須菜中分離出多種有抑藻活性的化感物質(zhì)， 其中亞油酸有較強(qiáng)的抑藻活性。這說明大型海藻中有多種化感物質(zhì)， 它們共同作用下可以對多種赤潮微藻產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。在本研究中， 裂片石莼藻粉對赤潮赤潮異彎藻的抑制效果強(qiáng)烈， 具體表現(xiàn)為OJIP曲線下降， 相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)改變， 并有較強(qiáng)的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)， 實驗所用的石莼藻粉放置于縮口小袋中，所以對赤潮異彎藻并無遮光作用和營養(yǎng)競爭， 也排除了微生物的干藻， 因此石莼藻粉對赤潮異彎藻的抑制作用很可能是其化感物質(zhì)所致， 這也與同類研究結(jié)果和結(jié)論一致[13—15，28]。實驗的裂片石莼干燥后被研磨成粉， 這一過程可能促進(jìn)了化感物質(zhì)的釋放， 增強(qiáng)了抑制效果[36]。如前文所述， 在本研究結(jié)果中， 石莼藻粉的抑藻效果低于羅麗娜研究結(jié)果[13]，其原因可能是赤潮異彎藻的起始生物量不同。而孫穎穎等[20]的實驗表明添加大藻粉不會造成營養(yǎng)鹽加劇的情況， 說明大型海藻防治赤潮有很高的實際可行性。

3.2 對赤潮異彎藻細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響

高生物量(4.8 g/L)的裂片石莼藻粉能破壞赤潮異彎藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 導(dǎo)致其葉綠體破裂， 類囊體排列混亂、片層斷開或融合， 同時破壞了線粒體、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)。石莼藻粉中的化感物質(zhì)可能是破壞赤潮異彎藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。張庭廷等[37]發(fā)現(xiàn)亞油酸能使銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)細(xì)胞內(nèi)離子外流、DNA等生物大分子向外釋放; 盧慧明[16]和余江等[17]在龍須菜中同樣分離出化感物質(zhì)亞油酸， 對2種赤潮微藻的細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)也有類似的破壞作用。關(guān)于大型海藻的化感物質(zhì)對赤潮微藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷機(jī)制報道并不多， 本實驗中石莼藻粉對赤潮異彎藻微觀結(jié)構(gòu)破壞明顯， 其機(jī)制需要更進(jìn)一步研究。另外， 僅少數(shù)藻類中有“基粒類囊體”結(jié)構(gòu)， 本實驗的透射電鏡結(jié)果表明赤潮異彎藻中無“基粒類囊體”。在研究藻類時， 不僅需要注意其表觀生長和光合效率的變化， 結(jié)合優(yōu)質(zhì)的透射電鏡觀察結(jié)果研究其微觀結(jié)構(gòu)變化也十分重要。

3.3 對赤潮異彎藻光合效率的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是反映植物光合效率的重要指標(biāo)， 在石莼藻粉的作用下， 赤潮異彎藻的OJIP曲線趨于直線、ABS/RC上升和Ψo下降等情況說明赤潮異彎藻的光合效率下降。有研究認(rèn)為OJIP曲線平緩是因QA以后的電子傳遞鏈?zhǔn)艿綋p壞[38]; 也有研究認(rèn)為是因為放氧復(fù)合體不能向PSⅡ提供電子[39];還有研究者認(rèn)為J-P相下降的原因是電子供側(cè)體受到了抑制[40]。在本研究中， PSⅡ最大光化學(xué)效率ψPo降低、超過QA的電子占比率Ψo和用于電子傳遞的能量ETo/RC減少也同樣說明了石莼藻粉破壞了赤潮異彎藻PSⅡ反應(yīng)中心， 使其光化學(xué)效率下降， 供側(cè)體提供電子減少， 電子傳遞鏈被阻斷在QA到QB處。許多同類研究也得到了類似的結(jié)果，然而相關(guān)研究者們沒有對這個結(jié)果做進(jìn)一步的解釋。本研究的透射電鏡結(jié)果表明葉綠體內(nèi)的微觀結(jié)變化可能是微藻光合效率下降的主要因素之一。

反應(yīng)中心處于類囊體膜上， 類囊體結(jié)構(gòu)的破壞將導(dǎo)致PSⅡ個數(shù)減少、性能下降， 這很可能是處理組單位反應(yīng)中心吸收光能量ABS/RC增多(圖3)而最大光化學(xué)效率ψPo降低的原因。在電子傳遞鏈中，電子可以自發(fā)傳遞到QA處， 但是從QA傳到QB需要伴隨著質(zhì)子的跨膜流動， 并隨后擴(kuò)散到類囊體膜中進(jìn)行下一步傳遞。光合電子傳遞鏈的幾個重要反應(yīng)都偶聯(lián)發(fā)生類囊體腔內(nèi)質(zhì)子的累積， 腔內(nèi)pH的降低會自動使電子傳遞速度慢下來， 類囊體膜是維持質(zhì)子濃度梯度的關(guān)鍵。由電鏡照片結(jié)果可知， 裂片石莼藻粉使赤潮異彎藻類囊體片層斷裂、融合， 這很可能導(dǎo)致膜兩側(cè)質(zhì)子梯度消失， 無法推動電子從QA傳到QB， 能量堆積于QA， 具體表現(xiàn)為單位反應(yīng)中心用于還原QA的能量TRo/RC增多(圖3)而傳遞超過QA的電子占比率Ψo減少。同時電子也難以有效的在斷開、融合的類囊體膜中進(jìn)行下一步傳播， 整個電子傳遞鏈所利用的能量減少， 即單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量ETo/RC和用于電子傳遞的量子產(chǎn)額ψEo減少。此外， 裂片石莼藻粉還破壞了赤潮異彎藻的線粒體、細(xì)胞核和細(xì)胞膜， 這將從能量代謝、遺傳和增殖等方面抑制其生長， 詳盡的機(jī)制還需要進(jìn)一步的工作予以解析。

4 結(jié)論

(1)大型海藻裂片石莼藻粉可以顯著降低赤潮異彎藻的光合色素含量， 使PSⅡ供側(cè)體和反應(yīng)中心性能下降， 阻斷電子傳遞， 從而降低光合效率; 同時裂片石莼藻粉可以破壞赤潮異彎藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 并且類囊體結(jié)構(gòu)的破壞可能是電子傳遞阻斷的主要原因之一。(2)大型海藻裂片石莼是一種潛在的防治以赤潮異彎藻為優(yōu)勢種所引發(fā)赤潮的“工具藻”，需對其生物防治赤潮實際應(yīng)用做更深入的研究。