賀影忠 李 松 姚如恩 王紀(jì)文

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心(上海 200127)；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海免疫學(xué)研究所(上海 200025)

結(jié)節(jié)性硬化（tuberous sclerosis，TSC）是累及多器官系統(tǒng)的常染色體顯性遺傳性疾病。TSC 在人群中的發(fā)病率為1/6000，近90%的TSC 患者伴有癲癇發(fā)作。致病基因TSC 1、TSC 2分別位于常染色體9 q 34、16 p 13.3[1]，其基因產(chǎn)物負(fù)反饋調(diào)節(jié)mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TSC 1或/和TSC 2基因變異可引起mTOR信號異常激活，細(xì)胞增殖及生長不受控制，從而形成多部位錯構(gòu)瘤等病理改變，同時可導(dǎo)致異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成，并誘發(fā)癲癇[2-4]。

目前，TSC 合并癲癇的臨床診斷和藥物選擇日趨成熟，雷帕霉素等mTOR 通路活性抑制劑應(yīng)用于臨床也逐漸得到認(rèn)同，有國際和國內(nèi)專家指南共識[5-6]。雷帕霉素是基于TSC發(fā)病機制的治療用藥，通過抑制mTOR復(fù)合體蛋白磷酸化從而抑制mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。但是雷帕霉素在臨床應(yīng)用存在一些問題，因此迫切需要能反應(yīng)mTOR 信號通路的活性并及時反饋用藥有效性的檢測指標(biāo)。本研究在檢測TSC 伴難治性癲癇患者的mTOR 通路中mTORC1活性的基礎(chǔ)上，通過監(jiān)測血細(xì)胞mTORC1活性，結(jié)合血藥濃度，著重評估患者體內(nèi)對不同濃度雷帕霉素的有效性，為臨床使用雷帕霉素及選擇合適的藥物劑量提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2019 年5 月至2020 年10 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心就診的TSC伴難治性癲癇患兒的臨床資料。TSC診斷參照2012年國際結(jié)節(jié)性硬化協(xié)作組新定義的TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。遺傳基因診斷標(biāo)準(zhǔn)：正常組織DNA檢查確定有TSC1或TSC2基因致病性變異即可確診TSC。藥物難治性癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)：患兒經(jīng)過兩種或以上正規(guī)抗癲癇藥物（AEDs）治療后（血藥濃度在有效范圍內(nèi)），癲癇發(fā)作頻率仍未完全控制或未減少一半，嚴(yán)重影響患兒的日常生活。排除標(biāo)準(zhǔn)：①服藥前化驗或體格檢查不合格者，具有嚴(yán)重的心肝腎疾病患者；②不愿或不能繼續(xù)參加本試驗者。出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)或因故中斷治療而無法評價療效者；③未到醫(yī)院進(jìn)行定期復(fù)查者（每1～3個月到院隨訪1次）或因資料不完整且失去聯(lián)系或不愿意配合隨訪者；④入選前3 個月內(nèi)已經(jīng)接受其他臨床試驗者，入組患兒監(jiān)護(hù)人簽署書面知情同意書。

雷帕霉素初始劑量均為每天1mg/m2體表面積，使用2～4周后根據(jù)雷帕霉素谷濃度和活性調(diào)整劑量，并維持治療隨訪觀察至少6個月，在隨訪期間AEDs種類未發(fā)生調(diào)整。

1.2 雷帕霉素濃度檢測方法

使用均相酶免疫測試技術(shù)分析全血中雷帕霉素含量。樣品中雷帕霉素與酶試劑中標(biāo)記重組6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）的雷帕霉素競爭性結(jié)合抗體，導(dǎo)致動態(tài)吸收光譜的改變，通過光密度計進(jìn)行測定，操作步驟見相關(guān)文獻(xiàn)[8]。

1.3 mTOR信號通路活性檢測方法

mTOR 信號通路主要由2 個包含mTOR 分子的復(fù)合物即mTORC 1 和mTORC 2 及其主要下游底物組成。底物S6第235位和第236位絲氨酸磷酸化（磷酸化抗體S6-S235/236）可以間接反映mTORC1活性，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT第473位絲氨酸的磷酸化（磷酸化AKT-S473）可反映mTORC2活性。mTORC1活性檢測操作參照文獻(xiàn)[9]。

通過流式細(xì)胞儀檢測熒光抗體并繪制圖表，縱坐標(biāo)顯示CD4或CD8細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)顯示mTORC活性。mTORC1和mTORC2活性分別由其對應(yīng)下游信號分子S 6 和AKT 的磷酸化含量來反應(yīng)，磷酸化越顯著曲線越右移，表明mTORC活性越高。

2 結(jié)果

2.1 一般資料和基因檢測結(jié)果

共收治26例TSC患兒，難治性癲癇并發(fā)癥25例，其中3 例患兒家屬拒絕使用雷帕霉素，22 例TSC 伴難治性癲癇患者治療過程中2例失訪，1例用藥半年后發(fā)生胃腸炎家屬自行停藥。入組19例TSC伴難治性癲癇患兒年齡8個月～13歲(中位年齡6歲)，男性11例、女性8例。19例患兒均出現(xiàn)腦部結(jié)節(jié)，17例有皮疹，10例伴腎囊腫/平滑肌瘤，10例伴心臟橫紋肌瘤（其中1例退化），1例出現(xiàn)肝結(jié)節(jié)。19例患兒發(fā)生癲癇后均規(guī)范使用2 種以上抗癲癇藥物，抗癲癇藥物血藥濃度在有效范圍內(nèi)，癲癇未控制。見表1。

19 例患兒均檢測TSC基因，3 例未見異常，4 例為TSC1變異，12例為TSC2變異。16例發(fā)現(xiàn)變異的患兒中，無義變異6例，移碼變異4例，錯義變異4例，剪切位點變異2例。見表1。

表1 19例TSC伴難治性癲癇患者臨床、基因變異及抗癲癇藥物使用情況

2.2 雷帕霉素血濃度和mTOR信號通路活性

TSC 伴難治性癲癇患兒mTORC 1 活性均高于對照組（圖1）。雷帕霉素用藥劑量增大，患者血細(xì)胞mTORC1活性也會逐漸下降（圖2）。

圖1 外周血細(xì)胞mTORC1 和mTORC2 活性測定結(jié)果

圖2 使用雷帕霉素前后外周血CD8 細(xì)胞mTORC1活性檢測結(jié)果

患兒雷帕霉素治療初始劑量為1mg/（m2·d），隨訪監(jiān)測患兒mTORC1活性和血雷帕霉素濃度，根據(jù)mTORC1活性和血雷帕霉素濃度調(diào)整劑量。如果患兒mTORC 1 活性高于正常對照或血雷帕霉素濃度＜3.0ng/mL，增加雷帕霉素劑量。達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度時藥物劑量1～2mg/（m2·d），血濃度波動于3.0～10.7 ng/mL，平均濃度（6.87±2.01）ng/mL。

2.3 治療及預(yù)后

患兒使用雷帕霉素治療，維持期雷帕霉素平均濃度為（6.87±2.01）ng/mL，用藥后隨訪至少半年以上，全部患兒驚厥得到不同程度控制，其中12 例完全控制，7例發(fā)作次數(shù)減少50%以上，其中3例發(fā)作次數(shù)減少75%以上。利用線性回歸分析，以雷帕霉素為自變量，驚厥控制程度為因變量（驚厥控制為1，驚厥減少75%為0.75，驚厥次數(shù)減少50%為0.5）得到的一元回歸方程為y=0.0251x+0.6035，R2=0.02661，擬合度較差，提示雷帕霉素平均濃度與癲癇控制沒有線性關(guān)系。用藥期間有2 例患兒出現(xiàn)一過性口腔潰瘍，未發(fā)現(xiàn)其他不良反應(yīng)。

3 討論

雷帕霉素靶蛋白是一種從酵母到人類在進(jìn)化上非常保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，其蛋白產(chǎn)物為雷帕霉素和FKBP12（FK506 binding protein）結(jié)合后的靶點，因此將哺乳動物中相應(yīng)蛋白命名為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）或者雷帕霉素機制性靶標(biāo)（mechanistic target of rapamycin,mTOR）。mTOR 蛋白在細(xì)胞中參與形成兩種各自具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白復(fù)合體，即對雷帕霉素敏感的mTOR 復(fù)合體1（mTORC 1）和對短期雷帕霉素處理不敏感的mTOR 復(fù)合體2（mTORC 2）。mTOR 復(fù)合體（mTORC）通過調(diào)控其底物的活性調(diào)節(jié)細(xì)胞的分解合成代謝和自噬進(jìn)而控制細(xì)胞生長[10]，可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元遷移和增殖、突觸生長和可塑性，增強神經(jīng)興奮性，并于個體發(fā)育停止后繼續(xù)調(diào)節(jié)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞功能[3,11]。mTOR 途徑過度激活引起神經(jīng)元變異，表現(xiàn)出藥物難治性癲癇、行為異常和認(rèn)知障礙其他神經(jīng)精神癥狀相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)[12-13]。使用mTOR 抑制劑可以獲得改善，因此mTOR 及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的靶點之一。第一代mTOR抑制劑包括雷帕霉素（又名西羅莫司）及其衍生物依維莫司。第二代mTOR 抑制劑目前尚處于探索階段。

本研究19例TSC伴難治性癲癇患兒，就診年齡8月～13歲不等，臨床均有顱內(nèi)病變，這與選取的患兒均為TSC 伴癲癇癥狀有關(guān)。皮疹發(fā)生率89.5%，腎囊腫/平滑肌瘤和心臟橫紋肌瘤發(fā)生率52.6%，但僅有1 例伴肝臟錯構(gòu)瘤，均無肺部淋巴管平滑肌瘤病，說明肝臟、肺部等部位病變可能更多見于年齡偏大的患者。19例患兒常規(guī)使用抗癲癇藥物控制癲癇效果差。在眾多抗癲癇藥物中，奧卡西平、開浦蘭、德巴金和妥泰是使用頻率最高的藥物。雖然對于TSC患者伴嬰兒痙攣癥，喜寶寧作為一線治療，類固醇和經(jīng)典抗癲癇藥物為二線治療[1]，但促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和喜寶寧在中國許多地方尚不能獲得，因此其使用受到一定限制。

TSC基因變異多樣，一般TSC 1致病性變異占30%左右。TSC2基因中變異個數(shù)遠(yuǎn)大于TSC1基因，TSC1基因包含23個外顯子，TSC2基因包含42個外顯子[14]。TSC 1和TSC 2基因變異類型有5 種：錯義變異、無義變異、移碼變異、剪切變異和大片段缺失，以錯義變異、剪切變異和移碼變異的發(fā)生率最高。TSC 1基因變異是無義變異或移碼變異、剪切變異，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯過程提前終止。而TSC 2的變異多為錯義變異（25%～32%）、大片段缺失或重組（12%～17%）[15]。本研究中，TSC基因未發(fā)現(xiàn)變異有3例，占15.8%；基因變異中TSC1、TSC2致病性變異占比分別為25%和75%，約為1∶3，以無義變異、錯義變異和移碼變異發(fā)生率最高。3例患兒未檢測出變異考慮可能是父母存在生殖細(xì)胞嵌合或內(nèi)含子序列受累，或者還有身份不明的基因位點或其他類型基因變異。

雷帕霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類藥物，主要作用于哺乳動物mTORC 1 蛋白，可與FKBP 12 形成復(fù)合物，實現(xiàn)對mTOR 及其下游信號分子的抑制，臨床上已經(jīng)開始用于治療結(jié)節(jié)性硬化伴癲癇患者[2-4]。2006年Franz 首次報告5 例TSC 患者室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（SEGA）予西羅莫司治療后體積均縮小，而停藥后體積再次增大。mTOR 抑制劑不僅可緩解TSC癥狀包括皮膚病變[16]，也對治療TSC相關(guān)癲癇有效[17-18]。French等[19]發(fā)現(xiàn)TSC患者癲癇的控制率與mTOR抑制劑有劑量依賴性，長期治療效果更好。早期使用mTOR抑制劑不僅可預(yù)防TSC繼發(fā)的癲癇，同時可以減少其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，抑制SEGA生長，減少結(jié)節(jié)數(shù)目和縮小體積[20]。本組患兒用藥后隨訪，12例驚厥控制，7例驚厥發(fā)作次數(shù)減少50%以上，說明雷帕霉素能有效控制癲癇發(fā)作。同時發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素用藥劑量增大，患者血細(xì)胞mTORC1活性也會逐漸下降，9 例患兒雷帕霉素加至每日1.5 mg/m2，1例患兒加至每日2 mg/m2時mTORC1活性基本降至正常對照。結(jié)合文獻(xiàn)我們把雷帕霉素初始劑量定為1 mg/（m2·d）。但雷帕霉素是mTOR抑制劑，主要是抑制瘤體增長，從而間接抑制驚厥發(fā)作，所以短期隨訪顯示雷帕霉素平均濃度與癲癇控制不呈正相關(guān)，兩者關(guān)系還需要長期隨訪療效的大樣本資料。2例TSC基因正常的患兒使用雷帕霉素后癲癇控制，提示未檢測出基因變異患者預(yù)后更好，但需要更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

臨床上主要通過監(jiān)測雷帕霉素濃度對患者用藥劑量進(jìn)行調(diào)節(jié)。但雷帕霉素應(yīng)用仍存在以下問題：①雷帕霉素過量使用會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，比如代謝紊亂、心血管不良反應(yīng)和胃腸紊亂，其中最嚴(yán)重的不良反應(yīng)是免疫抑制引發(fā)嚴(yán)重感染，如呼吸道感染、膿毒癥和泌尿道感染[21]，這些都是臨床用藥需要重點考慮的問題。②雷帕霉素用藥劑量有效范圍很大，文獻(xiàn)報道為1～5mg/（m2·d），針對每例患者的個體化最適用藥劑量的研究目前國內(nèi)外還是空白[2]。③用藥后血藥濃度檢測正常值范圍非常寬（血藥濃度正常值 0～30 ng/mL），根據(jù)血藥濃度臨床調(diào)整用藥劑量非常困難，不符合當(dāng)前提倡的精準(zhǔn)個體化治療要求。④許多醫(yī)院目前還不能進(jìn)行血藥濃度檢查，標(biāo)本外送化驗結(jié)果不及時。因此迫切需要能及時反應(yīng)mTOR信號通路的活性并及時反饋用藥有效性的檢測指標(biāo)。

本研究患兒隨訪半年，根據(jù)雷帕霉素濃度和mTORC 1 活性變化調(diào)整劑量，患兒使用劑量在1～2mg/（m2·d），平均劑量為1.3mg/（m2·d），平均血濃度為（6.87±2.01）ng/mL，這與文獻(xiàn)報道的最適濃度基本一致。但血濃度個體差異大，測定值波動于3.0～10.7ng/mL，說明單純依靠血濃度數(shù)值變化調(diào)整劑量還不能滿足個體化精準(zhǔn)用藥方案。同時人群遺傳背景存在異質(zhì)性，比如mTOR 通路不同蛋白的變異，相同蛋白不同位點的變異，即使是同一蛋白的相同變異，在不同的遺傳背景下對雷帕霉素的反應(yīng)也不完全相同，血藥濃度只是在測量抑制劑的多少，并不能完全反應(yīng)mTORC1活性是否恢復(fù)正常，而mTORC 1 活性恢復(fù)正常使病情有效控制并減少不良反應(yīng)才是最終目標(biāo)。所以，如果結(jié)合mTORC 1活性測定來定一個比較合理的血藥濃度區(qū)間，能更方便臨床醫(yī)師快速掌握患者用藥劑量和mTOR 信號通路活性變化的相關(guān)性，對用藥劑量進(jìn)行實時調(diào)整。

用流式細(xì)胞儀檢測mTORC 1 活性目前也存在不足。mTORC1通路活性測定是根據(jù)底物蛋白分子S6K或者S6的磷酸化進(jìn)行相對定量，無法精確進(jìn)行絕對值定量，目前樣本量少，即使設(shè)計決定定量方法也暫時無法評估其是否正確，需要累積數(shù)據(jù)；同時個體mTORC活性受飲食、抗癲癇藥物等較多影響，每次檢測需要當(dāng)天和受試人相同飲食的正常人對照標(biāo)本。如何通過比較S 6 K 或者S 6 蛋白量和磷酸化給mTORC 活性數(shù)字化并結(jié)合大量正常樣本和病人樣本進(jìn)行正常值的規(guī)定，將是下一步研究的重點。

對19 例TSC 伴難治性癲癇患兒雷帕霉素治療研究發(fā)現(xiàn)，定期檢測患者mTORC 1 活性變化，同時結(jié)合患者臨床用藥后驚厥控制情況、藥物不良反應(yīng)、血藥濃度來調(diào)整用藥劑量，對有效控制發(fā)病并避免不良反應(yīng)提供一種思路，可作為mTOR 通路異常的譜系疾病使用雷帕霉素治療的用藥參考，為臨床選擇合適的雷帕霉素劑量提供理論依據(jù)，有望為患者個體化用藥提供更精準(zhǔn)的治療方案。