方紅軍 楊 賽 曠小軍 江 志 周 珍 王麗娟 吳麗文 楊理明 劉舒蕾 廖紅梅

湖南省兒童醫(yī)院（湖南長沙 410007）

Duchenne 型肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是一種單基因遺傳病，DMD基因位于X 染色體上，是目前已知的人類最長的基因，跨越2.5 Mb 以上的基因組序列，由79 個外顯子組成。DMD基因編碼抗肌萎縮蛋白，后者維持肌纖維在收縮過程中肌膜的完整性，DMD基因變異導(dǎo)致其不完整或者部分功能缺陷從而致病。DMD基因變異會導(dǎo)致DMD或Becker肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD），統(tǒng)稱為肌營養(yǎng)不良[1]。該基因的框架外變異通常使得抗肌萎縮蛋白完全缺失，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的表型DMD；相反框內(nèi)變異通常與輕度BMD相關(guān)，伴有截短的抗肌萎縮蛋白表達。閱讀框規(guī)則適用于90%的病例，通常用于確診DMD并區(qū)分DMD和BMD[2]。DMD患者在兒童早期就出現(xiàn)了運動功能的快速惡化，男孩通常在12歲之前喪失行走能力。臨床診斷為DMD的患兒，首先需應(yīng)用多重連接依賴式探針擴增技術(shù)（MLPA）進一步驗證，用這種方法在大多數(shù)患兒中發(fā)現(xiàn)了缺失和重復(fù)，其是篩選這些變異的成本最低的方法。MLPA陰性者需要進一步應(yīng)用外顯組測序技術(shù)進行測序以檢測微小變異[3]。目前最普遍的治療包括糖皮質(zhì)激素、心臟保護、呼吸支持和康復(fù)功能訓(xùn)練，這些治療可以改善生活質(zhì)量，但不能逆轉(zhuǎn)疾病的臨床過程及改變結(jié)局。目前治療方法的研究熱點集中在基于DNA/ RNA的方法上，例如基于病毒載體的基因治療（基于DNA）[4]、基于成簇的規(guī)則間隔回文重復(fù)序列的基因編輯技術(shù)（基于DNA）[5]、終止密碼子通讀方法（基于RNA）和外顯子跳躍（基于RNA）[6]。本文總結(jié)DMD患兒的臨床及基因特點，以充實DMD數(shù)據(jù)庫，為DMD大型研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月至2020年6月在湖南省兒童醫(yī)院就診并通過臨床及基因檢測確診的DMD患兒171例的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡 0～18歲；②符合DMD 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，即進行性四肢近端肌無力，腓腸肌假性肥大，Gowers征陽性，血清肌酸激酶（CK）升高，肌電圖呈肌源性損害[7]；③應(yīng)用MLPA、外顯組測序及Sanger測序技術(shù)進行基因診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在精神病及其他神經(jīng)遺傳性疾??；②基因檢測陰性。

本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（No.HCHLL-2021-97）和研究對象法定監(jiān)護人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患兒年齡，性別，肌酶包括肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、乳酸脫氫酶（LDH），肝酶包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），發(fā)育情況，家族史等臨床資料。

1.2.2 標(biāo)本采集 采集患兒外周靜脈血2 mL 于EDTA 抗凝管中，使用血液DNA 提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），按說明書操作提取患兒全基因組DNA。

1.2.3 MLPA分析 取50 ng DNA 采用1×TE緩沖液定量至5 μL，采用MRC-Holland公司MLPA試劑盒進行DNA 變性、探針雜交、連接反應(yīng)、擴增，PCR 產(chǎn)物采用ABI 3730XL進行檢測，檢測結(jié)果通過COFFALYSER軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 外顯組測序 將先證者全血用全基因組DNA 提取盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司CWE 9600）提取基因組 DNA，取0.75 μg DNA樣本進行超聲打斷，打斷程序為50%強度超聲3 s 停1 s，共35 min，得到200～300 bp的DNA片段。采用KAPA高通量文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建DNA文庫。真空濃縮DNA 文庫樣本進行雜交捕獲，PCR 產(chǎn)物采用Ampure磁珠進行純化，并進行Qubit定量。取捕獲后的DNA樣本進行Illumina NovaSeq高通量測序。所有變異均通過Sanger測序驗證。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 測序數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina序列控制軟件評估合格后，進行數(shù)據(jù)讀取和生物信息學(xué)分析。

1.2.6 家系成員檢測 對同意行基因驗證的93例先證者母親采集外周靜脈血2～3 mL，根據(jù)先證者檢測到致病基因的不同類型選擇不同的驗證方法。若先證者為缺失、重復(fù)水平變異，則選擇MLPA方法進行驗證；若為單核苷酸水平變異，則用Sanger 測序法進行驗證。

1.2.7 ACMG 結(jié)果判讀 變異致病性判定主要依據(jù)ACMG指南2015版[8]，將基因變異類型分為良性變異、可能良性變異、臨床意義未明變異、致病性變異（包括可能致病變異和致病變異）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

171 例患兒中男165、女6 例；中位年齡4.1（1.7～7.0）歲，其中<1 歲21 例，～3 歲41 例，～7 歲65例，～13歲44例。23例患兒有相關(guān)家族史，5例二胎為DMD。

所有患兒就診時的CK中位數(shù)為4 840.0（1 796.0～8 877.5）U/L，LDH為1 003.0（758.0～1 240.4）IU/L，CKMB 為165.7（99.8～241.9）U/L，ALT 為290.3（191.0～414.1）IU/L，AST為185.0（143.0～288.1）IU/L，均明顯升高。

2.2 嬰幼兒首次神經(jīng)內(nèi)科就診原因

嬰兒組21例，男20例、女1例，因呼吸道、腸道感染等常見疾病或體檢發(fā)現(xiàn)肌酶升高就診者15 例（71.4%）、發(fā)現(xiàn)肝酶升高就診者3例（14.3%），因豎頭不穩(wěn)、雙手不能主動抓物、不能獨坐等運動落后癥狀就診者2 例（9.5%），因家族中有DMD 患者就診者1例（4.8%）。

幼兒組41例，男38例、女3例，因肌酶升高就診者16例（39.0%），因肝酶升高就診者7例（17.1%），因不喜自行走路、爬樓需扶行等運動障礙就診者15例（36.6%），因家族史就診者3例（7.3%）。

與幼兒組比較，嬰兒組因肌酶升高首次至神經(jīng)內(nèi)科就診比例較高（χ2=5.83，P=0.016），因運動落后就診比例較低（χ2=5.11，P=0.024），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 DMD基因大片段缺失/重復(fù)變異

171 例患兒中，111 例為大缺失變異（64.9%），26例為大重復(fù)變異（15.2%）。在111例大缺失變異患兒中，熱點變異位于兩個缺失區(qū)域，即基因中央?yún)^(qū)外顯子45～52區(qū)76例（占大缺失變異68.5%），5’端外顯子2～28區(qū)21例（占大缺失變異18.9%）；外顯子49～52區(qū)缺失（7例，占大缺失變異4.1%）和外顯子49～50區(qū)缺失（7例，占大缺失變異4.1%）為最常見的缺失。外顯子2～26區(qū)存在重復(fù)熱點17例，占所有大重復(fù)變異65.4%。大缺失變異中缺失最長的外顯子位于17～79 區(qū)，大重復(fù)變異中重復(fù)最長的外顯子位于13～44區(qū)。

本研究中共60 種缺失類型。其中在中央?yún)^(qū)外顯子45～52 區(qū)檢測到34 種缺失類型（34/76，占44.74%），而在5’端外顯子2～28區(qū)檢測到19種缺失類型（19/21，90.48%），兩個區(qū)域間缺失類型比例的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.89，P<0.001）。26例大重復(fù)變異中有24種不同的重復(fù)類型（92.3%）。見圖1、2。

圖1 進行性DMD 111 例致病DMD 基因大缺失定位圖

圖2 進行性DMD 26 例致病DMD 基因大重復(fù)定位圖

2.4 DMD基因點變異

171例患兒中34例為點變異（19.9%），其中4例錯義變異（2例未被報道）、17例無義變異（7例未報道）、6例移碼變異（4例未報道）、7例為非編碼區(qū)域的剪接變異（6例未報道）。DMD點變異貫穿于整個DMD基因中，第1區(qū)域（外顯子1～20）7例（20.6%）、第2區(qū)域（外顯子21～40）8例（23.5%）、第3區(qū)域（外顯子41～60）5例（14.7%）、第4區(qū)域（外顯子61～79）7例（20.6%）、第5區(qū)域（內(nèi)含子區(qū)）7例（20.6%）。其中外顯子10、16、27、34、35、64均出現(xiàn)2個點變異，其余均出現(xiàn)1個點變異。見表1。

表1 DMD基因單核苷酸水平致病性變異

2.5 先證者母親攜帶者狀況分析

共93例患兒做了母親驗證，58例母親為攜帶者，具有與子女相同的變異，攜帶率為62.4%。其中大缺失變異35例、大重復(fù)變異7例、點變異16例（其中錯義變異3例、無義變異9例、剪接變異3例、移碼變異1例）。

78 例母親未完成基因檢測，包括無再次生育需求23例、父母離異5例、抽血時母親不在現(xiàn)場18例、經(jīng)濟原因32例。

2.6 不同基因變異類型組間生化指標(biāo)比較

按照基因變異類型分成6組，分別為缺失組、重復(fù)組、錯義變異組、無義變異組、移碼變異組、剪接變異組。不同基因變異類型組間發(fā)病年齡及生化指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同基因變異類型對年齡、肌酶和肝酶的影響[M(P25～P75)]

3 討論

DMD是一種X連鎖的隱性神經(jīng)肌肉疾病，大約每3 500～5 000名男嬰中就有1例患病者[2]。由于缺乏維持肌肉細胞膜完整性所需的功能性肌營養(yǎng)不良蛋白，DMD 主要臨床表現(xiàn)為運動功能受損，患兒可出現(xiàn)寬基底步態(tài)或鴨步、運動發(fā)育落后、上樓困難、跑步慢、容易摔跤、抬頭無力，Gowers征陽性，一般3～5歲開始逐漸運動倒退，容易疲勞，部分患兒出現(xiàn)肌痛，后期可表現(xiàn)為腓腸肌假性肥大。大部分患兒可出現(xiàn)非運動功能障礙，如注意力不集中、行為異常、認(rèn)知及語言遲滯[9-10]，后期可出現(xiàn)心肺功能障礙，并最終死于心力或呼吸衰竭[11]。DMD起病隱匿，嬰幼兒通常不會出現(xiàn)典型的肌無力癥狀。本研究中嬰兒21例，幼兒41例，嬰兒因體檢或呼吸道感染等常見疾病檢查發(fā)現(xiàn)肌酶升高而首次至神經(jīng)內(nèi)科就診的比例較高，而幼兒因運動落后首次就診的比例較高。因此，對于有肌酶升高、運動落后等癥狀的患兒應(yīng)警惕，積極完善基因檢查。

DMD中最常見的變異是基因缺失。本研究中大缺失（111例，64.9%）和小缺失（6例，3.5%）占所有變異的68.4%；最常見的缺失熱點區(qū)域位于外顯子45～52區(qū)（68.5%），其次為外顯子2～26區(qū)（18.9%），結(jié)果與其他研究基本一致[12-13]。盡管在DMD基因的幾乎任何地方都可能發(fā)生缺失，但兩個熱點區(qū)域位于基因的中心部分和5'末端。與其他熱點相比，熱點中的某些缺失類型被檢測到的頻率更高。正如預(yù)期的那樣，在本研究和前期研究中，外顯子2～26和外顯子3～7 分別為復(fù)制熱點和最常見的外顯子復(fù)制模式[14]，與全球范圍內(nèi)的熱點區(qū)域和最常見的變異類型（重復(fù)、缺失）相似，這表明基于種族的DMD 中外顯子缺失和重復(fù)的比例差異很小[3]。本研究中不同基因變異類型組間患兒發(fā)病年齡、CK等生化指標(biāo)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能因各種基因變異類型可發(fā)生于DMD基因的任何位置且影響基因片段長度不等，無相對固定的發(fā)病年齡及疾病嚴(yán)重程度。

DMD呈X連鎖隱形遺傳病，具有以下特點：患者多為男性，男性患者雙親一般正常，母親為攜帶者，患者的兄弟、姨表兄弟、舅舅及外甥可能患病，呈非連續(xù)性遺傳。攜帶者狀態(tài)的確定對于攜帶者篩查和及時的遺傳咨詢都是至關(guān)重要的。由于缺乏有關(guān)遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷的知識，一些DMD家譜包含了多例患者。本研究中23例患兒有相關(guān)家族史，5例二胎為DMD。共93 例患兒做了母親驗證，其中58例患兒母親為攜帶者，攜帶率為62.4%。因此，對于DMD家系，應(yīng)該及時就醫(yī)，完善基因檢測以明確病因，家族中的女性成員均應(yīng)行攜帶者檢測，積極進行遺傳咨詢及評估生育風(fēng)險。當(dāng)前的遺傳咨詢將2/3的攜帶者風(fēng)險歸因于DMD 患兒的母親[3]。在進行攜帶者生育風(fēng)險評估時應(yīng)該掌握如下原則，男性后代中50%正常，50%患??；而女性后代一般不患病，但50%同為攜帶者。且新發(fā)變異中14%含有生殖腺嵌合體可能，也就是說DMD患兒母親雖未檢測到攜帶相同的致病基因，仍有產(chǎn)生異常配子的可能。因此新發(fā)變異患兒的母親在再次妊娠前，需進行產(chǎn)前咨詢。

目前DMD 常規(guī)藥物治療為腎上腺糖皮質(zhì)激素[15]，研究發(fā)現(xiàn)長期使用激素利大于弊，激素可以提高肌肉力量，延長步行能力，保持脊柱功能及心臟功能，增加肺功能，從而改善患兒健康狀況，延長壽命[16]。如果沒有接受皮質(zhì)類固醇治療，DMD有90%的機會可發(fā)展為進行性脊柱側(cè)彎[17]。DMD 的其他治療包括內(nèi)分泌治療，如睪酮及生長激素的治療。睪丸激素對骨胳健康以及心理社會情感的發(fā)展很重要，睪酮治療應(yīng)從低劑量開始，并緩慢增加，以模擬正常青春期[18]。但是沒有任何證據(jù)或文獻評估生長激素在不缺乏生長激素患兒中使用的安全性或有效性。研究表明在無癥狀的情況下，DMD患兒心肺功能也可能已經(jīng)受損，因此一旦確診DMD，需定期做心、肺功能檢查，及早發(fā)現(xiàn)問題、及早治療[19-20]。骨骼肌的管理也很重要，走路時保持正確的姿勢有助于預(yù)防背部、腳和踝關(guān)節(jié)的攣縮；在輪椅上安裝適當(dāng)?shù)淖幌到y(tǒng)，及支持脊柱和骨盆的對稱性和脊柱的伸展，是至關(guān)重要的[21-22]。

目前，基因治療研究很熱。基于RNA 的療法，例如終止密碼子通讀療法和外顯子跳躍療法[23]，給無義變異和大缺失變異的患兒帶來了希望。阿塔魯倫（ataluren）為翻譯通讀誘導(dǎo)藥物，能夠讀取mRNA中的提前終止密碼子，從而產(chǎn)生有功能性的肌營養(yǎng)不良蛋白，并已獲得歐洲藥品管理局的有條件批準(zhǔn)，可用于治療無義變異的DMD 患兒[24]。這項研究中有11.9%的患兒可以從該療法中獲益。反義寡核苷酸（AON）介導(dǎo)的外顯子跳躍是DMD患兒的另一種潛在療法，將框外轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)換為框內(nèi)轉(zhuǎn)錄物，誘導(dǎo)產(chǎn)生截短但是存在部分功能的肌營養(yǎng)不良蛋白[25-26]。依替普利森（etiplisen）用于外顯子51的跳躍[27]，已獲得FDA有條件批準(zhǔn)，多項臨床試驗證明依替普利森減輕了患兒步行能力的下降程度，使DMD患兒長期受益。同時，針對第53 外顯子的嗎啉反義寡核苷酸（PMO）golodirsen和針對第45外顯子跳躍的臨床試驗最近已啟動[28]。基因添加是一種很有前途的治療策略，對所有基因變異類型的患兒都具有普遍性。相關(guān)研究描述了一種來自外顯子50缺失的DMD患兒的誘導(dǎo)多能干細胞中的位點特異性基因添加策略。微型肌營養(yǎng)不良基因片段精確靶向定位于核糖體RNA基因（RDNA）位點。在經(jīng)過遺傳校正的誘導(dǎo)多能干細胞及其衍生心肌細胞中，抗肌萎縮蛋白的表達和膜定位都得到了恢復(fù)，在修飾的心肌細胞中觀察到了增強的自發(fā)收縮[29]。這些結(jié)果為DMD 朝著精確治療邁出重要一步。針對其他外顯子的反義寡核苷酸仍處于開發(fā)階段，并面臨許多挑戰(zhàn)[30]。因此，提供DMD變異詳細數(shù)據(jù)對于應(yīng)對這些挑戰(zhàn)至關(guān)重要。

本研究收集了171 例DMD 患兒的臨床資料及基因變異信息，對這些數(shù)據(jù)的分析表明，該人群中的變異分布與以往報道基本一致。本研究數(shù)據(jù)為DMD的基礎(chǔ)研究、臨床試驗及未來基因治療提供參考。