葉乃郗 何杰 李小燕 余覓 張維 孫建

[摘要] 目的 利用腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫探討DNA聚合酶εB亞基（POLE2）基因在肺腺癌中的表達(dá)及其對(duì)生存預(yù)后的影響。方法 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫和Oncomine數(shù)據(jù)庫分析不同肺腺癌數(shù)據(jù)集中POLE2 mRNA的表達(dá)情況，利用Kaplan-Meier Plotter進(jìn)行POLE2表達(dá)水平與肺腺癌病人總生存期的相關(guān)性分析。利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫和LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌組織中的POLE2表達(dá)相關(guān)基因。利用Enrichr數(shù)據(jù)庫和STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)POLE2表達(dá)相關(guān)基因進(jìn)行富集分析，利用TIMER數(shù)據(jù)庫了解POLE2與免疫細(xì)胞的關(guān)系。結(jié)果 與正常肺組織比較，肺腺癌組織中POLE2 mRNA水平呈高表達(dá)（|log2FC|=0.5，P<0.01）。高表達(dá)POLE2的肺腺癌病人總生存期更短（χ2=9.134，P<0.01）。與POLE2表達(dá)相關(guān)基因共37個(gè)。GO分析顯示，POLE2表達(dá)相關(guān)基因主要富集在DNA聚合酶的激活、DNA的復(fù)制、DNA的修復(fù)等生物學(xué)過程。KEGG通路分析顯示，POLE2表達(dá)相關(guān)基因主要參與了堿基切除修復(fù)、DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)等信號(hào)通路。蛋白相互作用分析顯示，PRIM2、POLA1、POLA2、CDC45等基因與POLE2有潛在的或密切的相互作用。POLE2基因在肺腺癌免疫微環(huán)境中與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞均無明顯相關(guān)性。結(jié)論 POLE2在肺腺癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后具有相關(guān)性，POLE2在肺腺癌中的高表達(dá)預(yù)示病人預(yù)后不良。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌;DNA聚合酶Ⅱ;基因表達(dá);計(jì)算生物學(xué)

[中圖分類號(hào)] R734.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2022）01-0073-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.008

肺癌是一種高發(fā)病率和高病死率的惡性腫瘤，隨著環(huán)境污染和職業(yè)暴露的加劇、吸煙人群的增多、人口老齡化的進(jìn)展，肺癌病人的數(shù)量呈逐年上升的趨勢。中國每年預(yù)計(jì)新增肺癌病例約70萬，新增肺癌死亡病例約40萬，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的70%以上，且非小細(xì)胞肺癌中主要為肺腺癌，而肺腺癌病人5年生存率不到15%[1-2]。究其原因可能是肺腺癌起病比較隱匿，早期無特殊癥狀，部分病人確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至中期以后，失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)。因此，早期確診和分子水平的研究有利于腫瘤的綜合治療和延長病人的生存期。

隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展和分子生物學(xué)設(shè)備的更新，肺癌在分子水平的發(fā)生發(fā)展機(jī)制得到深入研究。目前研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后與多種基因的差異表達(dá)相關(guān)[3-4]。其中DNA聚合酶εB亞基（POLE2）基因以其獨(dú)特的超強(qiáng)分子突變表型，與多種腫瘤都有著密切的關(guān)系[5]。LI等[6]研究結(jié)果表明，POLE2在肺腺癌的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的調(diào)控作用，下調(diào)該基因的表達(dá)后，A549細(xì)胞增殖受到明顯抑制。因此，研究POLE2基因在肺腺癌中的表達(dá)情況，可能為臨床治療方案的選擇及預(yù)后評(píng)估提供可靠依據(jù)。但目前POLE2在肺腺癌和正常肺組織中的表達(dá)情況及其對(duì)預(yù)后的影響鮮有報(bào)道，且該基因在腫瘤中的生物學(xué)功能爭議較大，現(xiàn)仍沒有研究運(yùn)用多個(gè)腫瘤數(shù)據(jù)庫對(duì)POLE2在肺腺癌中的作用進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。故本研究利用多個(gè)腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫綜合分析POLE2在肺腺癌組織中的表達(dá)水平及其對(duì)病人生存預(yù)后的影響，分析肺腺癌組織中的POLE2表達(dá)相關(guān)基因并預(yù)測其潛在的生物學(xué)功能，為研究POLE2基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程和生存預(yù)后中的作用提供一定的生物學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 POLE2表達(dá)量的數(shù)據(jù)提取

在GEPIA（Gene Expression Profiling interactive analysis）數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）平臺(tái)上選擇“Single Gene Analysis”，在“Enter gene name”中輸入“POLE2”，在“Datasets Selection”中輸入“LUAD”，分析POLE2在不同腫瘤中的表達(dá)情況。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫（http：//www.oncomine.org）分析在不同肺腺癌數(shù)據(jù)集中POLE2的表達(dá)情況，其篩選條件如下：①Cancer Type為lung adenocarcinoma;②Gene為POLE2;③Data Type為mRNA;④Analysis Type為Cancer vs. Normal Analysis;⑤Oncomine 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)納入條件為P<0.05，fold change>2，gene rank=top 10%。統(tǒng)一采用箱線圖對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行描述。

1.2 POLE2表達(dá)水平與肺腺癌病人總生存期的相關(guān)性分析

Kaplan-Meier Plotter（https：//kmplot.com/analysis）是一款操作簡單的在線分析基因表達(dá)量與生存數(shù)據(jù)間關(guān)系的工具。利用Kaplan-Meier Plotter，以POLE2表達(dá)量前25%的病人為高表達(dá)組，后25%的病人為低表達(dá)組，分析兩組病人的總生存時(shí)間并繪制生存曲線。

1.3 POLE2表達(dá)相關(guān)基因篩選

利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbioportal.org/）以及LinkedOmics數(shù)據(jù)庫（http：//www.linkedomics.org/login.php），共同分析TCGA（The Cancer Genome Atlas）子數(shù)據(jù)集LUAD（lung adenocarcinoma），以Pearson相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值>0.6為篩選條件，獲取POLE2表達(dá)相關(guān)基因。用在線分析工具（http：//www.bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）做韋恩圖，并獲取兩者的交集。下載的TCGA數(shù)據(jù)的研究主要對(duì)象為LUAD，其中具有RNA-seq測序數(shù)據(jù)的肺腺癌樣本517例。

1.4 POLE2生物學(xué)功能預(yù)測

先利用Enrichr數(shù)據(jù)庫（https：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）對(duì)POLE2表達(dá)相關(guān)基因進(jìn)行GO分析和KEGG 信號(hào)通路分析，篩選條件為P<0.05。然后，利用STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）分析相關(guān)蛋白間的相互作用，在“Multiple proteins”窗口中輸入包括POLE2在內(nèi)的一系列與POLE2表達(dá)相關(guān)的基因，物種選擇“Human”，代表蛋白間相互作用強(qiáng)度的置信度選擇“medium confidence（0.400）”。

1.5 POLE2基因與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤關(guān)系預(yù)測

所用TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）數(shù)據(jù)庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是由哈佛大學(xué)免疫信息學(xué)院建立的一個(gè)網(wǎng)站工具，它利用RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中6種免疫細(xì)胞的浸潤情況。分析設(shè)定條件如下：①Cancer為Lung Adenocarcinoma;②Gene為POLE2;③ Correlation為Pearson。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)驗(yàn)證肺腺癌和癌旁正常肺組織POLE2 mRNA的表達(dá)差異;用Pearson相關(guān)系數(shù)分析與POLE2相關(guān)的主要基因和浸潤免疫細(xì)胞;采用Kaplan-Meier生存分析計(jì)算病人的生存率，并使用廣義log-rank檢驗(yàn)估計(jì)生存預(yù)后的差異。

2 結(jié) 果

2.1 POLE2基因在不同腫瘤中的表達(dá)

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，POLE2基因在宮頸腺癌、睪丸癌等癌組織中的表達(dá)升高，而在急性髓細(xì)胞樣白血病中則呈現(xiàn)出低表達(dá)趨勢（圖1A）。POLE2基因在LUAD中的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織（|log2FC|=0.5，P<0.01）（圖1B）。Oncomine數(shù)據(jù)庫在線搜索共得到與POLE2表達(dá)相關(guān)的不同類型研究414項(xiàng)，其中47項(xiàng)研究結(jié)果顯示POLE2表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，45項(xiàng)研究顯示表達(dá)增高，2項(xiàng)研究顯示表達(dá)降低（圖2A）。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行篩選，從建庫至今，總共得到5項(xiàng)關(guān)于正常肺組織和肺腺癌組織POLE2表達(dá)比較的實(shí)驗(yàn)研究，包含172例樣本，這5項(xiàng)研究還包含了大細(xì)胞肺癌、鱗癌與正常肺組織POLE2表達(dá)的比較[7-9]。5項(xiàng)研究結(jié)果顯示，POLE2在肺腺癌、肺鱗癌及大細(xì)胞肺癌中的表達(dá)量均顯著高于正常肺組織（t=17.53～35.88，P<0.01），其中肺腺癌POLE2表達(dá)量增高尤為突出（圖2B、C）。

2.2 POLE2表達(dá)水平與肺腺癌病人預(yù)后的關(guān)系

以POLE2表達(dá)量前25%的病人為高表達(dá)組（n=123），后25%的病人為低表達(dá)組（n=123），進(jìn)行Kaplan-Meier Plotter分析，結(jié)果顯示，相對(duì)于高表達(dá)組，低表達(dá)組肺腺癌病人總體生存時(shí)間更長（χ2=9.134，P<0.01）。見圖3。

2.3 POLE2表達(dá)相關(guān)基因生物信息分析

利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫和LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析TCGA中肺腺癌的數(shù)據(jù)，共獲取37個(gè)與POLE2表達(dá)相關(guān)的基因（圖4）。利用Enrichr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)POLE2表達(dá)相關(guān)基因主要功能富集在DNA聚合酶的激活、DNA的復(fù)制和DNA的修復(fù)等生物學(xué)過程（圖5A）。KEGG 通路分析顯示，POLE2表達(dá)相關(guān)基因主要參與了堿基切除修復(fù)、DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)等信號(hào)通路過程（圖5B）。利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析顯示，節(jié)點(diǎn)數(shù)為11，POLE2在細(xì)胞增殖等相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于核心位置。根據(jù)MMC算法篩選潛在的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)PRIM2、POLA1、POLA2、CDC45等基因與POLE2表達(dá)密切相關(guān)。見圖6。

2.4 POLE2基因與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

利用腫瘤免疫微環(huán)境TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示，POLE2基因在肺腺癌免疫微環(huán)境中與B細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞均無明顯相關(guān)性（partial.cor<0.3），提示POLE2基因可能與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤無關(guān)。見圖7。

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的一種類型，包括肺鱗癌、肺腺癌、大細(xì)胞肺癌等，其中肺腺癌占絕大多數(shù)，其發(fā)病與環(huán)境因素、職業(yè)暴露、遺傳因素等諸多因素相關(guān)[10]。大部分肺腺癌病人確診時(shí)，可能已存在廣泛侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，目前對(duì)于中晚期肺腺癌暫無切實(shí)有效的治療措施[11]。傳統(tǒng)治療方法有放療、化療、手術(shù)切除治療等，但這些方法并沒有使病人的預(yù)后得到明顯的改善[12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的革新，基因靶向藥物和免疫治療成為了目前治療非小細(xì)胞肺癌的重要手段，并有效延長了病人的生存期，提高了病人的生活質(zhì)量[13]。在肺癌分子水平的研究過程中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)肺腺癌是一種在分子水平上呈現(xiàn)出高度異質(zhì)性的慢性疾病，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及基因的異常表達(dá)、腫瘤微環(huán)境變化、腫瘤免疫細(xì)胞浸潤、基因突變等，不同亞型肺腺癌的分子遺傳學(xué)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可能完全不同，從而導(dǎo)致肺腺癌的治療反應(yīng)和臨床預(yù)后也不盡相同[14]。因此，深入研究肺腺癌的發(fā)生機(jī)制及預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，對(duì)該病的臨床診斷、治療方案選擇、預(yù)后判斷具有重要價(jià)值。

POLE2基因是一種原癌基因，定位位于染色體14q22-q21上，分子量為59 000[15]。其主要功能是與人類DNA聚合酶ε其他兩個(gè)亞基（POLE3和POLE4）共同參與調(diào)控DNA的復(fù)制，催化DNA新鏈的合成，延長DNA新鏈的活性，進(jìn)一步催化核酸外切酶區(qū)的校正活性等[16]。但該基因在腫瘤中的生物學(xué)功能目前仍不明確。李娜苗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，POLE2基因與肺癌A549細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，下調(diào)肺癌A549細(xì)胞POLE2基因的表達(dá)，可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖。因此推測POLE2可能在肺腺癌中發(fā)揮著重要作用。

雖然POLE2基因在食管癌、直腸癌、乳癌以及肺癌組織中均有表達(dá)[18-19]，但由于不同的研究實(shí)驗(yàn)條件不同，且單個(gè)研究樣本量相對(duì)較小，結(jié)論還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過GEPIA、Oncomine等多個(gè)公共數(shù)據(jù)庫中肺腺癌病人的基因表達(dá)譜和臨床信息來闡明POLE2在肺腺癌中的預(yù)后價(jià)值和潛在機(jī)制。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫研究顯示，POLE2在包括肺腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)。Oncomine作為目前全世界最大的基因芯片數(shù)據(jù)庫研究平臺(tái)，給廣大醫(yī)學(xué)研究者提供了不同腫瘤的基因芯片信息，綜合這些信息進(jìn)行分析，可以有效減少因樣本量較小導(dǎo)致的抽樣誤差，增加結(jié)論的可靠性。本研究在Oncomine數(shù)據(jù)庫中檢索出POLE2基因表達(dá)有關(guān)研究414項(xiàng)，其中47項(xiàng)研究結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，45項(xiàng)研究顯示表達(dá)增高，2項(xiàng)研究顯示表達(dá)降低，總共包含172例研究樣本。

符合篩選條件的研究有5項(xiàng)，對(duì)其進(jìn)行薈萃分析，顯示POLE2基因差異表達(dá)中位數(shù)值排名為500.0，在肺腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)。Oncomine和GEPIA兩個(gè)數(shù)據(jù)庫相互驗(yàn)證結(jié)果表明，POLE2在肺腺癌中確實(shí)為高表達(dá)，該結(jié)果與李娜苗等[17]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。分析其原因可能為，POLE2突變使得基因原本具有的校正功能缺失，大量堆積的偶然突變，抑制了Sp1元件的活性，使啟動(dòng)子活性不能得到完全激活，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞生長緩慢甚至死亡[20]。因此，POLE2基因?qū)τ诜蜗侔┎∪松骖A(yù)后的判斷有著重要意義。本研究Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)檢索結(jié)果也驗(yàn)證了POLE2表達(dá)水平的高低與肺腺癌病人的總生存期相關(guān)，腫瘤組織POLE2基因表達(dá)水平高的病人總生存期比低表達(dá)組病人更短。HARTMANN等[21]的研究結(jié)果表明，在淋巴細(xì)胞腫瘤病人中，POLE2作為易感基因，其表達(dá)水平用于預(yù)測淋巴瘤病人的生存期也有重要價(jià)值。WU等[22]研究同樣得出相似的結(jié)論，即POLE2的高表達(dá)預(yù)示著肺鱗癌病人預(yù)后更差。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是，POLE2作為DNA復(fù)制、修復(fù)、重組和細(xì)胞周期控制的核心組分，主要涉及兩條有意義的通路，即堿基切除修復(fù)通路和核苷酸切除修復(fù)通路，通過調(diào)節(jié)這兩條通路中的上下游分子影響DNA復(fù)制、細(xì)胞的凋亡和增殖[23]，從而影響病人的預(yù)后;其次，POLE2在肺腺癌中是一個(gè)癌基因，其致癌機(jī)制與POLE2高突變負(fù)荷和免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的高表達(dá)有關(guān)[24]。本研究進(jìn)一步通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析POLE2與免疫細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果顯示POLE2在肺腺癌免疫微環(huán)境中與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞均無明顯相關(guān)性。提示POLE2基因可能與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤無關(guān)。推測其原因可能為POLE2的功能更多的是直接參與調(diào)控細(xì)胞的周期和增殖，而不是通過免疫細(xì)胞起作用。

因?yàn)楸狙芯亢Y選的基因芯片數(shù)據(jù)量大，樣本量較多，且方法異質(zhì)性較低，故本研究結(jié)果真實(shí)可靠。但由于樣本來源不同，可能會(huì)對(duì)最終結(jié)果造成一定的誤差;同時(shí)，本研究結(jié)論缺乏獨(dú)立的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，故需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以確認(rèn)。

綜上所述，本研究通過深入挖掘以O(shè)ncomine為主的多個(gè)數(shù)據(jù)庫中POLE2基因芯片信息，證明POLE2基因在肺腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且該基因高表達(dá)的肺腺癌病人總生存期更短。本研究結(jié)果可能為肺癌藥物的研發(fā)和肺癌病人的預(yù)后評(píng)估提供一定的生物學(xué)依據(jù)。

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（本文編輯 馬偉平）

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