汪貫習(xí) 周縝 王悅 梁鳳 李洪波 徐穎婕

[摘要] 目的 探討低分子量褐藻多糖硫酸酯（LMWF）對小鼠動脈粥樣硬化（AS）作用。方法 選擇ApoE（-/-）雄性小鼠40只，隨機分為對照組、模型組、陽性對照組和治療組，每組10只。模型組、陽性對照組和治療組應(yīng)用高脂飼料喂養(yǎng)，對照組應(yīng)用普通飼料喂養(yǎng)。陽性對照組和治療組小鼠分別給予普羅布考和LMWF 0.5 mL灌胃干預(yù)治療，對照組和模型組小鼠同步給予體積分數(shù)0.02橄欖油0.5 mL灌胃。采用生物化學(xué)方法檢測小鼠血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，油紅O染色和蘇木精-伊紅染色方法檢測動脈內(nèi)膜粥樣硬化斑塊的面積和結(jié)構(gòu)，TUNEL法檢測動脈內(nèi)膜細胞凋亡情況。結(jié)果 與對照組比較，模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C和ox-LDL水平顯著升高，而HDL-C顯著降低（F=21.98～114.31，P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組和治療組小鼠血清TG、TC、LDL和ox-LDL水平顯著降低，HDL水平顯著升高（P<0.05）;治療組小鼠TG、TC、LDL-C和ox-LDL水平明顯低于陽性對照組，而HDL-C水平明顯高于陽性對照組（P<0.05）。治療組小鼠動脈粥樣斑塊的面積較模型組顯著縮?。‵=595.39，P<0.01），動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)顯著改善（F=122.16，P<0.05），動脈內(nèi)膜的細胞凋亡程度顯著降低（F=8 128.51，P<0.01）。結(jié)論 LMWF能調(diào)控ApoE（-/-）小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，抑制粥樣硬化斑塊的形成，減緩AS的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 動脈粥樣硬化;褐藻多糖硫酸酯;膽固醇，LDL;細胞凋亡;小鼠

[中圖分類號] R282.72

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）01-0068-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.028

動脈粥樣硬化（AS）是心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]，AS發(fā)生發(fā)展涉及大量炎性細胞和細胞因子[2]，炎性細胞和細胞因子促進了斑塊的形成[3]。低密度脂蛋白（LDL）滯留在血管內(nèi)膜下是AS的主要病理機制，富含膽固醇的載脂蛋白聚糖上的糖胺聚糖能夠通過LDL激活免疫應(yīng)答啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)[4]。脂質(zhì)氧化作用可以導(dǎo)致具有生物活性的脂類釋放，其中的LDL顆粒可以被修飾成為氧化LDL（ox-LDL）[5]，引起內(nèi)皮細胞功能紊亂、炎性因子的釋放，促進血管平滑肌細胞（VSMC）遷移和泡沫細胞的形成，最終形成AS斑塊[6]。研究證實，心血管疾病病人血漿ox-LDL水平明顯升高，活性氧（ROS）的產(chǎn)生能夠?qū)е翷DL的氧化，而ox-LDL又能促進內(nèi)皮細胞、VSMC和巨噬細胞中ROS的形成[7-8]。褐藻中提取的天然產(chǎn)物褐藻多糖硫酸酯，尤其是低分子量褐藻多糖硫酸酯（LMWF）具有眾多高效的生物活性[9]，其對內(nèi)皮細胞和巨噬細胞有一定的調(diào)控作用[10]。本文研究LMWF對高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE（-/-）小鼠[11]血脂代謝和AS斑塊形成的影響，探討LMWF是否有抗AS的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海藻提取物LMWF樣品由中國科學(xué)院海洋研究所張全斌研究員提供，主要成分為高度硫酸化的α-L-巖藻糖和D-半乳糖及少量D-甘露糖、D-木糖、D-鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖和糖醛酸[9]。SPF級7周齡ApoE（-/-）雄性小鼠40只，體質(zhì)量為20～24 g，北京華阜康生物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于青島大學(xué)動物實驗中心，室溫（22±2）℃、濕度（60±5）%，12 h /12 h明暗周期，自由飲食。標準高脂塊狀飼料，每100.00 g含脂肪21.00 g、膽固醇0.15 g。

1.2 實驗方法

ApoE（-/-）小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（A組）、模型組（B組）、陽性對照組（C組）和治療組（D組），每組10只。對照組：小鼠普通飼料喂養(yǎng)，0.5 mL橄欖油（體積分數(shù)0.02）灌胃給藥;治療組：高脂飼料喂養(yǎng)，200 mg/kg LMWF（用體積分數(shù)0.02橄欖油溶解至0.5 mL）溶液灌胃;陽性對照組：高脂飼料喂養(yǎng)，200 mg/kg普羅布考（Probucol，用體積分數(shù)0.02橄欖油溶解至0.5 mL）溶液灌胃給藥;模型組：高脂飼料喂養(yǎng)，體積分數(shù)0.02橄欖油0.5 mL灌胃。各組給藥均隔日1次，連續(xù)16周。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 血脂檢測 給藥結(jié)束后第2天，100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，經(jīng)心臟取血1 mL，生化采血管收集，靜置3 h，以4 000 r/min離心10 min，分離血清。全自動生化分析儀（AU 5800，貝克曼庫爾特有限公司）檢測血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.3.2 血清ox-LDL檢測 應(yīng)用ox-LDL ELISA試劑盒（Bio-Maide公司）檢測，按說明書操作。每個樣品孔先加40 μL樣品稀釋液，后加10 μL樣品。每孔加50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，于37 ℃避光靜置15 min。終止顯色反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，Spectramax M5多功能酶標儀測定450 nm波長處各孔吸光度，制作標準曲線，計算ox-LDL濃度。

1.3.3 AS粥樣斑塊面積檢測 用油紅O染色方法。經(jīng)心臟取血后，每組隨機取小鼠5只，分別切取主動脈1 cm，縱行剖開展平，置于40 g/L多聚甲醛固定2 h，流水沖洗，油紅O染色5 min，體積分數(shù)0.60異丙醇分化5 s，蘇木精復(fù)染2 min。甘油明膠封固。光鏡下觀察AS斑塊位置，計算斑塊面積。

1.3.4 AS粥樣斑塊病理結(jié)構(gòu)觀察 采用蘇木精-伊紅（HE）染色方法。經(jīng)心臟取血后，每組取剩余小鼠5只，分別切取主動脈1 cm，置40 g/L多聚甲醛固定2 h，流水沖洗后用OCT包埋，液氮速凍。冷凍切片機（HM 505E，德國美康有限公司）連續(xù)切片，厚度10 μm，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上。蘇木精染色5 min，鹽酸乙醇分化5 s，伊紅染色90 s。常規(guī)脫水、透明、封片。光鏡下觀察，粥樣斑塊呈紅褐色，觀察AS斑塊位置并計算斑塊面積。

1.3.5 細胞凋亡檢測 采用In Situ細胞凋亡試劑盒（羅氏有限公司）檢測，按說明書方法操作。熒光顯微鏡（Olympus BX53，Japan）下450～500 nm波長處觀察，凋亡細胞呈綠色熒光。隨機觀察5個視野，測定吸光度值，取均值，以其表示細胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK（Students-Newman-Keuls）法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血脂水平比較

各組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較，差異有顯著性（F=21.98～114.31，P<0.05），其中模型組TG、TC、LDL-C水平較對照組顯著升高，而HDL-C顯著降低（P<0.05）;陽性對照組和治療組TG、TC和LDL-C水平較模型組均明顯降低，而HDL-C水平升高（P<0.05）;治療組小鼠TG、TC、LDL-C水平明顯低于陽性對照組，而HDL-C水平明顯高于陽性對照組（P<0.05）。各組小鼠血清ox-LDL水平比較差異有顯著性（F=111.79，P<0.05），其中模型組ox-LDL水平較對照組顯著升高（P<0.05），而治療組與陽性對照組血清ox-LDL水平較模型組均顯著降低，且治療組下降更為顯著（P<0.05）。見表1。

2.2 各組主動脈AS斑塊面積比較

油紅O染色顯示，對照組小鼠主動脈可見散在的橘紅色AS斑點，面積為（53±5）mm2;模型組出現(xiàn)明顯的大片狀A(yù)S斑塊，面積為（230±16）mm2;陽性對照組的AS斑塊呈現(xiàn)條紋狀，面積為（116±10）mm2;治療組小鼠的AS斑塊呈散點狀，面積為（75±6）mm2。各組AS斑塊面積比較，差異有顯著性（F=595.39，P<0.01），其中治療組與陽性對照組小鼠斑塊面積均較模型組減?。≒<0.05），且治療組減小更為顯著（P<0.05）。見圖1。

2.3 各組主動脈病理結(jié)構(gòu)比較

HE染色顯示，對照組小鼠主動脈內(nèi)膜光滑，未見明顯的病理改變;模型組小鼠主動脈內(nèi)膜增厚、粗糙，出現(xiàn)明顯的紅褐色AS斑塊，斑塊面積為（165±25）μm2;治療組主動脈內(nèi)膜變薄，斑塊面積為（68±5）μm2;陽性對照組主動脈內(nèi)膜斑塊面積為（93±11）μm2。治療組、陽性對照組主動脈內(nèi)膜粥樣斑塊面積與模型組比較均顯著性減?。‵=122.16，P<0.05），尤其是治療組動脈內(nèi)膜相對光滑，粥樣硬化斑塊面積顯著低于陽性對照組（P<0.01）。見圖2。

2.4 各組主動脈內(nèi)膜細胞凋亡比較

熒光顯微鏡下觀察，對照組小鼠主動脈內(nèi)膜光滑;模型組小鼠主動脈內(nèi)膜凹凸不平，出現(xiàn)凋亡細胞，血管壁內(nèi)膜處細胞凋亡尤為明顯;治療組與陽性對照組小鼠動脈壁的細胞凋亡熒光強度顯著減弱。對照組吸光度值為105±7，模型組為760±85，治療組為150±12，陽性對照組為170±16，4組吸光度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8 128.51，P<0.01），其中任意兩組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

3 討 論

目前研究普遍認為，AS是由遺傳和環(huán)境等多種危險因素共同作用引起的疾病，高脂血癥、高血壓、肥胖、吸煙、年齡和糖尿病等是AS的傳統(tǒng)危險因素[12]。起初人們對AS的認識只限于AS是脂質(zhì)堆積造成的動脈管壁堵塞而已，但近年實驗研究和臨床試驗證明，炎癥反應(yīng)在AS及其并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。目前有多種學(xué)說從不同角度探討了AS的發(fā)生機制和病理過程，例如炎癥學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、脂質(zhì)滲入學(xué)說、平滑肌突變學(xué)說和內(nèi)皮損傷學(xué)說等[13-15]。AS發(fā)生的起始階段，主動脈、冠狀動脈和腦動脈等大動脈部位脂質(zhì)堆積并持續(xù)增加，其分支點和彎曲區(qū)極易形成AS斑塊，循環(huán)的脂蛋白顆粒浸潤至這些區(qū)域的動脈管壁，干擾局部內(nèi)皮細胞正常功能，導(dǎo)致脂質(zhì)及炎癥因子在動脈內(nèi)膜堆積，促進了AS斑塊的產(chǎn)生[16]。AS斑塊一旦破裂，會引起一系列急性臨床疾病的發(fā)生，如腦卒中和急性心肌梗死等，導(dǎo)致病人癱瘓或者死亡。

AS是心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，其發(fā)生發(fā)展涉及大量炎性細胞和細胞因子。在AS早期，內(nèi)皮功能障礙和脂質(zhì)代謝紊亂會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化和細胞通透性的改變[4]。TG、TC、LDL-C和HDL-C是AS主要的臨床生化評價指標，在AS的發(fā)生發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用[7]。ApoE（-/-）純合子小鼠是被公認的一種AS血管損傷模型，具有形成AS的基礎(chǔ)，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)一定時間后，就會出現(xiàn)典型的AS癥狀體征、血生化及血管病理改變[17]。本研究應(yīng)用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE（-/-）小鼠，結(jié)果顯示，模型組小鼠血清TG、TC和LDL-C水平較對照組均顯著升高，而HDL-C水平則顯著降低，說明AS動物模型構(gòu)建是成功的;治療組TG、TC和LDL-C水平較模型組均明顯降低，而HDL-C水平升高;治療組小鼠TG、TC、LDL-C水平明顯低于陽性對照組，而HDL-C水平明顯高于陽性對照組，說明LMWF具有與普羅布考同樣的降脂作用，且LMWF的降脂作用更為明顯。

在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，內(nèi)皮細胞通透性改變，ox-LDL積累在內(nèi)皮細胞下，刺激單核細胞分化為巨噬細胞，進而導(dǎo)致平滑肌細胞增生和遷移、血小板聚集、白細胞黏附和炎癥細胞因子的釋放等變化，促進了AS發(fā)生發(fā)展過程[18]。其中，巨噬細胞吞噬過量產(chǎn)生的ox-LDL形成泡沫細胞，泡沫細胞以壞死核為中心沉積在壞死核周圍形成脂紋，最終發(fā)展為AS斑塊[19]。LMWF具有多種生物學(xué)活性如抗氧化、抗炎性、抗血栓以及保護內(nèi)皮細胞功能等[20]。本研究油紅O染色和HE染色結(jié)果均表明，模型組小鼠形成了明顯的AS斑塊;與模型組比較，治療組AS斑塊面積減少，說明LMWF對AS小鼠主動脈的損傷有明顯的抑制和改善作用，以此減緩AS的發(fā)生發(fā)展。提示LMWF可能通過抗氧化作用抑制AS的發(fā)生和發(fā)展。

游離的TG、TC、LDL-C和ox-LDL是強促炎性刺激因子，可引起更多巨噬細胞的聚集，脂質(zhì)（TG和TC）、巨噬細胞、平滑肌細胞、細胞外基質(zhì)、鈣和壞死碎片構(gòu)成了AS斑塊的主要成分[21]。LMWF能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程，抑制血管平滑肌細胞的遷移和內(nèi)膜增生，減弱內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的血管生成過程而防治AS斑塊的形成[22]。本文的研究結(jié)果顯示，LMWF與傳統(tǒng)降脂藥物普羅布考的作用相似，能夠降低血清TG、TC、LDL-C和ox-LDL水平，提高HDL-C的水平，而且治療組小鼠TG、TC、LDL-C水平顯著低于陽性對照組，HDL-C水平顯著高于陽性對照組，提示LMWF可作為潛在的降脂藥物。細胞凋亡可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞死亡和巨噬細胞浸潤，凋亡的巨噬細胞會促進脂紋的產(chǎn)生，最后形成AS斑塊[23-24]。本研究結(jié)果顯示，LMWF還能明顯抑制ApoE（-/-）小鼠動脈壁內(nèi)膜的細胞凋亡，減少巨噬細胞的浸潤，減緩AS的發(fā)展。

綜上所述，LMWF能調(diào)控ApoE（-/-）小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，通過抗氧化機制，抑制細胞凋亡和粥樣硬化斑塊的形成，減緩AS的發(fā)展。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

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