楊婉 呂秋蘭 徐大星 劉秀 王鵬君 邢士超

[摘要] 目的 探討可溶性尿酸（sUA）對腸上皮細胞的影響及其機制。方法 將大鼠腸上皮細胞（IEC-6細胞）隨機分為對照組和實驗組，對照組采用0 mg/L sUA刺激IEC-6細胞;實驗組分別用25、50、100、200、400 mg/L濃度的sUA刺激IEC-6細胞，觀察sUA對細胞活力的影響，并篩選出對IEC-6細胞毒性較小的sUA濃度。采用蛋白印跡法和實時熒光定量PCR，檢測sUA刺激對IEC-6細胞蛋白激酶C（PKC）、腫瘤壞死因子α（TNFα）表達的影響;采用PKC抑制劑抑制PKC的表達，觀察PKC降低對炎癥因子表達的影響。采用活性氧檢測試劑盒檢測sUA對IEC-6細胞線粒體活性氧（ROS）的影響，線粒體膜電位試劑盒檢測IEC-6細胞膜電位變化，免疫熒光方法檢測IEC-6細胞緊密連接蛋白（ZO-1）表達。結果 25、50、100 mg/L濃度sUA刺激組細胞活力與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;200、400 mg/L濃度 sUA刺激組細胞活力受損較為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（F=20.519，P<0.05）。25、50、100 mg/L濃度sUA刺激組IEC-6細胞PKC、TNFα mRNA和蛋白表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=36.750～81.660，P<0.05）。PKC抑制劑組PKC、TNFα蛋白表達顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.646、22.572，P<0.05）。25、50、100 mg/L濃度sUA刺激組ROS較對照組增多（F=341.708，P<0.05）。50、100 mg/L濃度sUA刺激組線粒體膜電位較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=400.952，P<0.05）。100 mg/L濃度sUA刺激組ZO-1蛋白表達較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=50.508，P<0.05）。結論 sUA能激活由PKC介導的免疫應答，產(chǎn)生過量的ROS，釋放炎癥因子，引起腸上皮細胞炎癥反應。

[關鍵詞] 腸細胞;高尿酸血癥;尿酸;緊密連接蛋白質類

[中圖分類號] R392.6

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）01-0013-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.010

尿酸是核酸及嘌呤類化合物的最終代謝產(chǎn)物。除腎臟外，約有1/3尿酸經(jīng)腸上皮細胞轉運至腸腔內(nèi)代謝[1]。腸上皮細胞功能紊亂是引發(fā)代謝病的風險因素，目前尿酸對腸上皮細胞的影響尚不清楚。腸上皮細胞在保護腸道屏障，調節(jié)黏膜免疫系統(tǒng)等方面具有重要的作用[2]。腸屏障功能受損后，腸道通透性增加，易引發(fā)一系列的炎癥[3-5]。蛋白激酶C（PKC）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是控制細胞分化、增殖等過程的重要調節(jié)因子[6]。本研究采用大鼠腸上皮細胞（IEC-6細胞）模型探討可溶性尿酸（sUA）能否激活誘導炎癥反應、引起腸上皮細胞損傷，為高尿酸血癥及其并發(fā)癥的預防和治療提供新的方向。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

IEC-6細胞（CRL-1592）購自ATCC美國模式培養(yǎng)物集存庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液、胰蛋白酶、Trizol、三氯甲烷均購于碧云天公司;二甲基吡啶（MTS）細胞增殖試劑盒、二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）活性氧檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、細胞核染料DAPI均購于索萊寶公司;引物、Taq DNA聚合酶購于上海生物工程公司;緊密連接蛋白（ZO-1）抗體購于美國CST公司;PKC抗體、腫瘤壞死因子α（TNFα）抗體、β-actin抗體、羊抗兔IgG抗體購于美國Abcam公司;PKC抑制劑（Sotrastaurin）購于APE×BIO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 IEC-6細胞培養(yǎng) 配制含有體積分數(shù)0.10的胎牛血清、100 kU/L青霉素G和100 U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，將IEC-6細胞置于該培養(yǎng)基中，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長至80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 sUA制備 取1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解尿酸鹽，充分攪拌后配制成20 g/L的尿酸溶液，用0.22 μm注射式過濾器過濾，制成澄清淡黃色溶液。

1.2.3 細胞活力檢測 IEC-6細胞分別用0、25、50、 100、 200、 400 mg/L濃度sUA刺激24 h后，改用不含血清的培養(yǎng)基，按照MTS細胞增殖試劑盒說明，加入MTS放于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。使用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度值，以其表示細胞活力。

1.2.4 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測PKC、TNFα mRNA表達 分別應用0、25、50、100 mg/L濃度的sUA（分別為A、B、C、D組）刺激IEC-6細胞6 h，RT-PCR方法檢測PKC、TNFα mRNA表達。根據(jù)試劑說明書步驟進行操作。所用引物及其序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.5 PKC和TNFα蛋白表達檢測 采用Wes-tern blot方法。分別用0、25、50、100 mg/L濃度的sUA（分別為A、B、C、D組）刺激IEC-6細胞24 h;PKC抑制劑組應用100 mg/L濃度sUA刺激IEC-6細胞24 h后，加入0.05 mg/L的PKC抑制劑繼續(xù)刺激24 h。去除培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次。加入RIPA裂解液，室溫下12 000 r/min離心取上清液，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。各組取30 μL總蛋白加入SDS-PAGE凝膠蛋白上樣緩沖液，放入100 ℃金屬浴煮沸10 min后進行SDS-PAGE凝膠分離。蛋白經(jīng)凝膠電泳分離后，轉印至硝酸纖維素膜上。加入50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入兔源PKC抗體（1∶1 000）、TNFα抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。以TBST清洗3次，每次10 min。加入二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h后，以TBST洗膜3次。最后通過化學發(fā)光法顯影，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白灰度值的比值表示PKC、TNFα蛋白表達水平。

1.2.6 細胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平測定 應用DCFH-DA ROS檢測試劑盒。IEC-6細胞接種在12孔板，分別用0、25、 50、 100 mg/L濃度sUA（分別為A、B、C、D組）刺激24 h后，去除細胞培養(yǎng)液，加入10 mg/L熒光探針DCFH-DA。將細胞放于37 ℃環(huán)境中孵育20 min，用無血清培養(yǎng)液清洗3次，去除殘余未進入細胞內(nèi)的探針，最后應用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞中ROS的含量。

1.2.7 細胞線粒體膜電位檢測 采用JC-1線粒體膜電位試劑盒。IEC-6細胞接種在12孔板，分別加入0、25、50、100 mg/L濃度sUA（分別為A、B、C、D組）刺激24 h后，棄去原有培養(yǎng)液，PBS沖洗;加入JC-1工作液，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min;孵育結束后，使用JC-1緩沖液洗滌3次。設置熒光酶標儀的激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長590 nm，檢測各組細胞線粒體膜電位。 以熒光信號的強度表示細胞線粒體膜電位的變化。

1.2.8 ZO-1表達檢測 采用免疫熒光方法。選取100 mg/L濃度的sUA刺激IEC-6細胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次后，加入40 g/L的多聚甲醛室溫固定30 min;再次用PBS沖洗3次，加入5 g/L的Tritox-100，室溫靜置20 min;去除Tritox-100液后PBS漂洗3次，室溫下應用體積分數(shù)0.05山羊血清封閉30 min，然后加入ZO-1抗體，4 ℃孵育過夜;吸出一抗，PBS沖洗;加入熒光二抗，室溫孵育1 h。細胞核染料DAPI染核，使用熒光顯微鏡觀察熒光強度，使用Image Pro Plus軟件分析ZO-1表達水平。

以上所有實驗均重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料結果以[AKx-D]±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度sUA刺激對IEC-6細胞活力的影響

與0 mg/L sUA刺激組（對照組）相比較，200、400 mg/L濃度 sUA刺激組細胞活力降低，差異有顯著性（F=20.519，P<0.05）。25、 50、 100 mg/L 濃度sUA刺激組細胞活力與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。因此，為了避免sUA刺激導致細胞死亡而影響實驗結果，后續(xù)實驗采用25、 50、 100 mg/L濃度的sUA。

2.2 sUA刺激對IEC-6細胞PKC、TNFα mRNA和蛋白表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，25、50、100 mg/L濃度sUA刺激組IEC-6細胞PKC mRNA的表達均高于0 mg/L濃度sUA刺激組（對照組），差異有統(tǒng)計學意義（F=51.317，P<0.05）。Western blot檢測結果顯示，50、100 mg/L濃度sUA刺激組的PKC蛋白表達較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義（F=73.293，P<0.05）。25、50、100 mg/L濃度sUA刺激組TNFα蛋白和mRNA表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=81.660、36.750，P<0.05）。見圖2和表2。

2.3 PKC抑制劑對PKC及TNFα表達的影響

加入PKC抑制劑（實驗組）刺激IEC-6細胞24 h后，PKC抑制劑組PKC、TNFα蛋白表達顯著低于0 mg/L濃度sUA刺激組，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.646、22.572，P<0.05）。見圖3和表3。

2.4 sUA刺激對IEC-6細胞線粒體膜電位及ROS水平的影響

50、100 mg/L濃度sUA刺激組線粒體膜電位與0 mg/L濃度sUA刺激組（對照組）相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=400.952，P<0.05）。與對照組相比較，25、50、100 mg/L濃度sUA刺激組ROS以劑量依賴性方式升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=341.708，P<0.05）。見表4。

2.5 sUA刺激對IEC-6細胞ZO-1蛋白及細胞核DAPI染色的影響

以100 mg/L濃度sUA刺激組（實驗組）ZO-1以及細胞核DAPI染色表達明顯低于0 mg/L濃度sUA刺激組（對照組），差異均具有統(tǒng)計學意義（t=50.508、199.070，P<0.05）。見圖4和表5。

3 討 論

高尿酸血癥不僅會導致痛風，同時還與糖尿病、肥胖等代謝疾病密切相關[7-9]。腸道是尿酸排泄的重要途徑，腸上皮細胞作為腸屏障的一部分，在維持腸道微生態(tài)相對穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[10-11]。腸黏膜上皮細胞與尿酸的相互作用不僅影響尿酸的轉運與代謝，還可能損傷腸黏膜屏障，從而促進炎癥以及代謝疾病的發(fā)生[12-13]。目前，有關尿酸對腸上皮細胞影響的研究較少。探討尿酸對腸道上皮細胞的影響及其機制，對深入了解高尿酸血癥的發(fā)病機制及發(fā)生發(fā)展過程有著重要的意義。

尿酸是一種內(nèi)源性危險信號，結晶后的尿酸晶體能誘導炎癥反應，激活免疫系統(tǒng)[14-15]。目前大部分研究集中于探討尿酸晶體誘發(fā)的炎癥反應及免疫過程。有研究顯示，sUA可能是一種促炎劑，能夠不依賴尿酸晶體誘發(fā)炎癥反應和免疫過程[16-18]。本研究結果表明，25、50、100 mg/L的sUA刺激能顯著激活IEC-6細胞的PKC通路介導的免疫應答，促進TNFα等炎癥因子表達，引發(fā)炎癥反應。為了進一步探究該過程中PKC通路對炎癥因子表達增加是否起關鍵作用，本文檢測抑制細胞中PKC的表達后PKC、TNFα蛋白水平的變化。結果顯示，sUA刺激可增加IEC-6細胞中PKC的表達，抑制PKC表達后PKC、TNFα蛋白表達顯著降低。

ROS作為一種重要的信號分子，可調節(jié)細胞的代謝、增殖并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[19]。已有研究表明，線粒體產(chǎn)生過量的ROS，引起炎性細胞因子的分泌[20]。尿酸最初被認為是一種抗氧化劑，可以去除ROS，防止老化和氧化應激[21]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，尿酸不一定是抗氧化劑，某些情況可能會變成促氧化劑。SAUTIN等[22]研究表明，尿酸能激活成熟脂肪細胞中NADPH氧化酶并促使ROS產(chǎn)生增加，誘導脂肪細胞中的氧化還原依賴性信號傳導和氧化應激。高濃度的尿酸還可引起β-細胞、血管平滑肌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化應激[23-25]。結合本研究結果，我們推測sUA導致ROS的產(chǎn)生可能是引起炎癥反應的另一個機制，但需要進一步的研究探討。

由于線粒體是細胞中ROS的主要來源，本文進一步研究了sUA刺激對線粒體膜電位的影響。結果表明，高濃度的sUA刺激可導致IEC-6細胞線粒體膜電位下降。線粒體膜電位對維持線粒體功能具有重要作用，若線粒體受損則會通過低效氧化磷酸化不斷增加ROS的產(chǎn)生，損害細胞功能[26]。有研究顯示，高尿酸血癥可改變細胞內(nèi)線粒體的面積與功能，使機體處于氧化應激狀態(tài)[27-28]。本文結果與其一致。提示sUA可能通過誘導IEC-6細胞氧化應激，增加ROS的產(chǎn)生，最終導致線粒體損傷。

ZO-1蛋白連接鄰近的腸上皮細胞，并且與調節(jié)腸道通透性的胞漿肌動蛋白和肌球蛋白網(wǎng)絡有關[29-30]。本文研究結果顯示，當sUA濃度為200、400 mg/L時，IEC-6細胞活力明顯降低，對IEC-6細胞毒性較大。提示sUA破壞了腸細胞間的ZO-1蛋白，進一步損壞腸黏膜屏障，而這些變化與尿酸引起的炎癥反應密切相關。

綜上所述，尿酸能激活PKC信號通路，改變細胞氧化應激狀態(tài)，反饋上調炎癥因子的表達，進一步擴大炎癥反應。尿酸引起的炎癥反應可能是其損害腸道黏膜屏障的重要機制之一。這一發(fā)現(xiàn)對于進一步研究高尿酸血癥并發(fā)癥的機制及靶點治療具有重要的指導意義。但該研究結果還需要進一步的動物實驗驗證。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

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