張瑜，任春娜，劉嬋娟，宮玉鳳

（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 牡丹江 157000）

宮頸癌在女性惡性腫瘤中較為常見，其主要的病發(fā)原因是人乳頭病毒HPV的感染，也可能與個(gè)人生活方式及遺傳因素相關(guān)[1]。隨著診斷及治療技術(shù)的發(fā)展，該病病發(fā)率及病死率不斷下降，預(yù)后也有了一定程度的改善，但患者3 年期生存率仍處于較低水平[2-3]。miRNA屬于內(nèi)生非編碼RNA分子的一種，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)，miRNA表達(dá)水平的異常，可能預(yù)示癌癥細(xì)胞的發(fā)生與增殖[4]。miR-599 全稱MicroRNA-599，已有研究證明，miR-599在卵巢癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5]。但關(guān)于其對(duì)宮頸癌的臨床癥狀表達(dá)及預(yù)后的影響鮮有研究?；诖?，本研究擬對(duì)miR-599 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR 檢測(cè)，以了解其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2018 年 1 月至 2021 年 1 月本院收治的宮頸癌患者60例，平均年齡（55.7±1.2）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理會(huì)審核批準(zhǔn)?；颊呔鶎?duì)本研究知情并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織活檢確診為宮頸癌；②首次發(fā)?。虎凼中g(shù)期間未死亡；④無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不完整者；②合并其他惡性腫瘤者；③術(shù)前放化療者；④合并糖尿病、高血壓、冠心病者。

1.2 方法

1.2.1 獲取標(biāo)本 于術(shù)后采集所有患者癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本，使用RNA 提取盒提取RNA 并使用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，在EP管中保存分裝，于-80 ℃環(huán)境下冷藏。

1.2.2 定量熒光RNA 檢測(cè) 使用全自動(dòng)熒光定量PCR 分析儀對(duì)miR-599 進(jìn)行擴(kuò)增，在95 ℃下反應(yīng)，總體系為20 μl，反應(yīng)時(shí)間為15 min；之后94 ℃反應(yīng)15 s；55 ℃反應(yīng)30 s；70 ℃反應(yīng)34 s，如此循環(huán)40次，最終采集熒光信號(hào)并使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將miR-599類似物在宮頸癌Hela 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，在96 孔板中置入Hela 細(xì)胞，將孔板置入細(xì)胞箱中培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、60 h 時(shí)加入 CCK-8 試劑，以每孔吸光度分析細(xì)胞增殖能力，以此為觀察組，并與經(jīng)過(guò)miRNC轉(zhuǎn)染的對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.2.4 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力將不含20%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基置于Tran‐swell板的上室，將含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基置于Transwell板的下室，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞適量接種到上室中，培養(yǎng)后對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行染色，挑選5 個(gè)區(qū)域，對(duì)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析，以確定細(xì)胞的遷移能力。使用覆蓋基質(zhì)膠的膜分隔上下室，進(jìn)行細(xì)胞侵襲的分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“”表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞組織中miR-599 的表達(dá)情況 宮頸癌患者癌性組織內(nèi)miR-599的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同組織中miR-599的表達(dá)水平比較（）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-599 in different tissues()

表1 不同組織中miR-599的表達(dá)水平比較（）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-599 in different tissues()

組別癌性組織癌旁正常組織t值P值例數(shù)60 60 miR-599/U6 1.02±0.24 0.87±0.21 5.589 0.005

2.2 miR-599的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 以U6表達(dá)量標(biāo)定為相對(duì)表達(dá)量參考，＜U6=1 為低表達(dá)，＞U6=1 為高表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-599的表達(dá)與宮頸癌FIGO 分期、宮頸癌病理組織分化有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 宮頸癌血清miR-599表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 2 The relationship between serum miR-599 expression and clinicopathological parameters in cervical cancer

2.3 miR-599 的表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在下調(diào)Hela 細(xì)胞中的miR-599 表達(dá)后，采用 CCK-8 法從第 48 小時(shí)開始，Hela細(xì)胞的增殖能力明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），而侵襲下室的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05），見表3。

表3 下調(diào)miR-599表達(dá)后Hela細(xì)胞中增殖能力比較（）Table 3 Comparison of proliferation ability in Hela cells after down-regulating the expression of miR-599()

表3 下調(diào)miR-599表達(dá)后Hela細(xì)胞中增殖能力比較（）Table 3 Comparison of proliferation ability in Hela cells after down-regulating the expression of miR-599()

組別對(duì)照組（n=60）觀察組（n=60）t值P值12 h 0.43±0.11 0.44±0.12 0.476 0.456 24 h 0.72±0.21 0.67±0.25 0.291 0.321 36 h 1.52±0.24 1.42±0.36 0.423 0.352 48 h 2.59±0.54 2.07±0.75 2.765 0.012 60 h 3.32±0.93 2.52±0.99 3.283 0.015侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）103.45±13.12 53.54±10.43 4.355 0.001

2.4 miR-599的表達(dá)與預(yù)后生存期的關(guān)系 將患者按照miR-599表達(dá)水平的不同劃分為低表達(dá)組與高表達(dá)組，統(tǒng)計(jì)兩組患者預(yù)后生存期發(fā)現(xiàn)，1年、2年存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高表達(dá)者3 年期存活率低于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 不同表達(dá)的miR-599水平的患者預(yù)后生存期比較[n（%）]Table 4 Comparison of prognosis and survival of patients with different expression levels of miR-599[n(%)]

3 討論

宮頸癌原發(fā)于女性子宮頸部，是由HPV病毒感染所致，其臨床癥狀根據(jù)患者個(gè)體差異有不同的表現(xiàn)，初期可能無(wú)任何癥狀，但隨著疾病的發(fā)展，患者可能出現(xiàn)接觸性流血或陰道流血，伴隨貧血、氣虛、發(fā)熱、四肢酸痛等癥狀，疾病晚期會(huì)出現(xiàn)腎功能損害、身體消瘦、大出血等嚴(yán)重癥狀，危及患者生命安全[6-7]。因此，探尋宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找生物標(biāo)記分子的不同表達(dá)與臨床及預(yù)后的關(guān)系，對(duì)于宮頸癌的診斷與治療具有重要意義[8]。miRNA是真核生物細(xì)胞單鏈非編碼RNA 的一種，包含有18～25 個(gè)核苷酸，可參與基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[9]。miRNA包含眾多成員，有研究發(fā)現(xiàn)，miR216-a的下調(diào)，與患者腫瘤分化、腫瘤形態(tài)及大小、腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，能影響細(xì)胞的增殖、遷徙、與侵襲[10]。說(shuō)明miRNA 對(duì)于癌癥的發(fā)生和發(fā)展具有促進(jìn)作用，可作為治療癌癥的新靶點(diǎn)。miR-599 廣泛存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞和組織中，有研究表明，miR-599下調(diào)可參與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，對(duì)于癌細(xì)胞的增殖與侵襲具有抑制作用[11]。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌患者癌性組織內(nèi)miR-599 的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），提示miR-599可參與宮頸癌的早期診斷。本研究結(jié)果還顯示，miR-599 的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的FIGO 分期及腫瘤組織分化相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明miR-599的表達(dá)對(duì)于宮頸癌疾病的臨床病理可起到一定預(yù)測(cè)作用。有研究[12]對(duì)于miR-599在卵巢癌中的表達(dá)與細(xì)胞的侵襲與增殖進(jìn)行研究，結(jié)果顯示miR-599 在卵巢癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，且下調(diào)miR-599的表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的分化與增殖。本研究結(jié)果顯示，在下調(diào)宮頸癌患者Hela 細(xì)胞中的miR-599表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力與侵襲能力明顯降低，提示miR-599 有望成為抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的新靶點(diǎn)。在對(duì)預(yù)后的統(tǒng)計(jì)分析中，miR-599 高表達(dá)的患者3年期存活率明顯低于低表達(dá)者（P＜0.05），提示miR-599 的高表達(dá)與宮頸癌患者的生存率相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[13]。

宮頸癌患者癌性組織中miR-599的表達(dá)明顯高于非癌組織，miR-599的表達(dá)與病理組織分化、細(xì)胞的增殖與侵襲能力、患者存活率密切相關(guān)，可作為診斷及治療中的預(yù)測(cè)因子。