侯彥茹 趙 旭* 黃華山 張金紅 井長(zhǎng)偉

(1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，臨沂276000；2.山東隆大生物工程有限公司，臨沂276400；3.山東亞太中慧集團(tuán)有限公司，濰坊262400)

近些年來(lái)，我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速，人民生活水平提高，關(guān)于肉類的消費(fèi)理念發(fā)生了很大變化。人們?cè)谧非笕狻傲俊钡耐瑫r(shí)，更加注重對(duì)肉“質(zhì)”的要求。由于肌內(nèi)脂肪含量與雞肉嫩度和風(fēng)味均呈顯著正相關(guān)[1]，因此想要達(dá)到提高雞肉品質(zhì)這一要求，增加雞肉的肌內(nèi)脂肪含量是必不可少的。目前，抗生素被禁用，益生素和酸化劑等通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮功效的飼料添加劑日益得到人們重視。大量研究表明，益生素和酸化劑等動(dòng)物腸道微生物調(diào)節(jié)類飼料添加劑具有增加雞肉的肌內(nèi)脂肪含量的作用[2-4]，但其作用機(jī)制尚未明確。血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4)是一類具有高效生物活性的分泌蛋白，與動(dòng)物脂肪代謝密切相關(guān)，同時(shí)腸道微生物可影響其分泌[5]。由此，我們猜測(cè)ANGPTL4可能是益生素和酸化劑等動(dòng)物腸道微生物調(diào)節(jié)類飼料添加劑調(diào)控肉雞肌內(nèi)脂肪沉積的一個(gè)重要媒介。肌內(nèi)脂肪是脂肪合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解的凈產(chǎn)物。由于本課題組前期已就ANGPTL4對(duì)肉雞胸肌脂肪分解的影響進(jìn)行了探究[6]。因此，本試驗(yàn)將在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以肉雞肝臟和胸肌為主要研究對(duì)象，就ANGPTL4對(duì)肉雞脂肪合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響進(jìn)行研究，以期探明ANGPTL4在肉雞胸肌肌內(nèi)脂肪的作用效果，為揭示營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)控肉雞肌內(nèi)脂肪沉積的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參照趙旭等[4]的方法制備帶有組氨酸(histidine，His)-小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier，SUMO)標(biāo)簽的雞ANGPTL4重組蛋白(濃度為0.1 mg/mL)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

試驗(yàn)分體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)和體外細(xì)胞試驗(yàn)2部分進(jìn)行。

體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)：選用36只體重[(2.17±0.03) kg]相近的35日齡健康禁食狀態(tài)下(空腹12 h)愛拔益加肉公雞，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞。對(duì)照組翅靜脈注射滅菌的生理鹽水，試驗(yàn)組分別翅靜脈注射20、100、500、2 500、12 500 ng/kg BW的雞ANGPTL4重組蛋白，注射劑量均為550 μL，注射后30 min(ANGPTL4最佳生效時(shí)間)，所有肉雞頸靜脈放血處死，取相同部位肝臟樣品置于非液氮型樣品RNA保存液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)中，4 ℃保存過(guò)夜，第2天后以-20 ℃保存；分別取相同部位肝臟和胸肌樣品，液氮速凍，-40 ℃保存。

體外細(xì)胞試驗(yàn)：以肉雞成肌細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)3個(gè)組，分別是滅菌的生理鹽水組、His-SUMO標(biāo)簽組和雞ANGPTL4重組蛋白組，分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加滅菌的生理鹽水、His-SUMO標(biāo)簽蛋白(其含量與雞ANGPTL4重組蛋白組中標(biāo)簽蛋白含量一致)和雞ANGPTL4重組蛋白(250 pg/mL)，添加劑量均為5 μL，5% CO2、37 ℃孵育24 h。采集肉雞成肌細(xì)胞用于測(cè)定甘油三酯(TG)含量。整個(gè)細(xì)胞試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)

采用TRIzol(Invitrogen Life Technologies公司，美國(guó))方法提取總RNA。按照TaKaRa試劑盒(TaKaRa公司，日本)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算肝臟脂肪代謝相關(guān)目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。

1.3.2 肝臟脂肪合成相關(guān)酶活性

使用脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、蘋果酸酶(malic enzyme，ME)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)分別測(cè)定FAS、ME、ACC活性，測(cè)定過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.3 胸肌脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)活性

使用總脂酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定胸肌LPL活性，測(cè)定過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.4 成肌細(xì)胞TG含量

采集成肌細(xì)胞使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定成肌細(xì)胞TG含量，測(cè)定過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件中的one-way ANOVA程序進(jìn)行分析，多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行。采用正交多項(xiàng)式的分析方法對(duì)不同注射劑量雞ANGPTL4重組蛋白的處理效應(yīng)進(jìn)行一次線性和二次曲線回歸分析。數(shù)據(jù)用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟脂肪合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，20、100、500、2 500 ng/kg BW雞ANGPTL4重組蛋白組的肝臟FASmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，但20、100、500、2 500 ng/kg BW雞ANGPTL4重組蛋白組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨著雞ANGPTL4重組蛋白注射劑量增加，肝臟FASmRNA相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)一次線性和二次曲線增加的效應(yīng)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，100、500、2 500 ng/kg BW雞ANGPTL4重組蛋白組的肝臟MEmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，但100、500、2 500 ng/kg BW雞ANGPTL4重組蛋白組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，12 500 ng/kg BW雞ANGPTL4重組蛋白組的肝臟ACCmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。隨著ANGPTL4重組蛋白注射劑量增加，肝臟ACCmRNA相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)一次線性和二次曲線降低的效應(yīng)(P<0.05)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

表2 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟脂肪合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

2.2 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟脂肪合成相關(guān)酶活性的影響

由表3可知，不同注射劑量的雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟ME和ACC活性均無(wú)顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，500ng/kgBW雞ANGPTL4重組蛋白組的肝臟FAS活性顯著提高(P<0.05)。隨著雞ANGPTL4重組蛋白注射劑量增加，肝臟FAS活性呈現(xiàn)一次線性和二次曲線增加的效應(yīng)(P<0.05)。

表3 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟脂肪合成相關(guān)酶活性的影響

2.3 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

由表4可知，不同注射劑量的雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟載脂蛋白B(ApoB)和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTTP)mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞肝臟脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

2.4 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞胸肌LPL活性的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，500 ng/kg BW雞ANGPTL4重組蛋白組的胸肌LPL活性顯著增加(P<0.05)。

2.5 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞成肌細(xì)胞TG含量的影響

由圖1可知，雞ANGPTL4重組蛋白組的成肌細(xì)胞TG含量顯著高于生理鹽水組和His-SUMO標(biāo)簽組(P<0.05)，但生理鹽水組和His-SUMO標(biāo)簽組之間成肌細(xì)胞TG含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

肌內(nèi)脂肪是脂肪合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解的凈產(chǎn)物。對(duì)于肉雞而言，其肝臟是合成脂肪酸的主要場(chǎng)所，90%脂肪在此合成[7-9]。脂肪酸合成的過(guò)程是首先將線粒體內(nèi)的乙酰輔酶A利用檸檬酸-丙酮酸循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞液，然后以乙酰輔酶A為原料合成丙二酸單酰輔酶A，通過(guò)循環(huán)反應(yīng)延長(zhǎng)碳鏈得到合成的脂肪酸。在該過(guò)程中，ACC、FAS和ME均參與其中。ACC可利用ATP將CO2固定在與酶結(jié)合的生物素上并將CO2轉(zhuǎn)移給乙酰輔酶A從而生成丙二酸單酰輔酶A[10]。此反應(yīng)是脂肪酸合成第一階段的限速反應(yīng)，其中ACC發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[11]。FAS是具備多項(xiàng)功能的一個(gè)酶系統(tǒng)，能夠催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A生成棕櫚酸，是脂肪酸合成方面主要的限速酶之一，并依靠其數(shù)量和活性對(duì)動(dòng)物體脂沉積呈現(xiàn)顯著影響[12]。ME參與了檸檬酸-丙酮酸循環(huán)，可在胞液中催化蘋果酸脫羧，且該過(guò)程中產(chǎn)生的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)大多被利用于長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成[13]。在本試驗(yàn)中，翅靜脈注射500 ng/kg BW雞ANGPTL4重組蛋白時(shí)，F(xiàn)ASmRNA相對(duì)表達(dá)量和FAS活性顯著升高，表明一定劑量的雞ANGPTL4重組蛋白能通過(guò)調(diào)控肝臟FASmRNA表達(dá)及其活性來(lái)促進(jìn)脂肪酸碳鏈的延伸，從而參與脂肪沉積的過(guò)程。同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射一定劑量的雞ANGPTL4重組蛋白，ME、ACCmRNA相對(duì)表達(dá)量與無(wú)變化的ME、ACC活性呈現(xiàn)出明顯的不對(duì)應(yīng)性，其原因可能是雞ANGPTL4重組蛋白僅參與調(diào)控了ME、ACCmRNA的轉(zhuǎn)錄，但對(duì)其蛋白質(zhì)翻譯無(wú)影響。因?yàn)橹竞铣蛇^(guò)程主要受酶活性的影響，因此，綜合ACC、FAS和ME這3種脂肪合成相關(guān)酶活性的試驗(yàn)結(jié)果可知，雞ANGPTL4重組蛋白具有促進(jìn)肉雞肝臟脂肪合成的作用。

表5 雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)肉雞胸肌LPL活性的影響

NS：生理鹽水組 normal saline group；His-SUMO：His-SUMO標(biāo)簽組 His-SUMO tag group；His-SUMO-ANGPTL4：雞ANGPTL4重組蛋白組 chicken ANGPTL4 recombinant protein group。

ApoB位于低密度脂蛋白(LDL)的表面，約占總蛋白的97%，是一種在肝臟生成的蛋白質(zhì)，其能夠在乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)和LDL的合成方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[14-15]，并具有將其轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟外組織的功能。MTTP是一種位于細(xì)胞微粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，可參與肝細(xì)胞中VLDL和小腸細(xì)胞中CM的合成和分泌[16]，且能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔作為載體與含有脂蛋白的ApoB結(jié)合，以VLDL的形式將脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟。本試驗(yàn)中，ApoB和MTTPmRNA表達(dá)不受雞ANGPTL4重組蛋白的影響。由此可知，雞ANGPTL4重組蛋白對(duì)于肝臟中脂肪的轉(zhuǎn)出無(wú)影響。綜合以上肝臟脂肪合成和轉(zhuǎn)出的試驗(yàn)結(jié)果可知，雞ANGPTL4重組蛋白可促進(jìn)肝臟脂肪的沉積。

目前關(guān)于ANGPTL4調(diào)控肝臟脂肪代謝的研究主要是集中于鼠上。Mandard等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食狀態(tài)下，過(guò)表達(dá)ANGPTL4鼠較野生型鼠的脂肪肝現(xiàn)象更明顯。Xu等[18]研究表明，由腺病毒介導(dǎo)的ANGPTL4過(guò)表達(dá)能夠誘發(fā)C57小鼠產(chǎn)生高脂血癥、肝腫大和脂肪肝癥狀。由此可見，ANGPTL4與肝臟脂肪代謝密切相關(guān)。本試驗(yàn)中，雞ANGPTL4重組蛋白可促進(jìn)肝臟脂肪沉積的結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

LPL是由脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白，多是在緊鄰組織器官的小毛細(xì)血管內(nèi)皮管腔面產(chǎn)生作用[19]，能將血液中CM和VLDL攜帶的TG分解出甘油和脂肪酸，并將其作為脂肪組織合成TG的原料，從而促進(jìn)脂肪沉積。在小鼠和人上已經(jīng)證實(shí)ANGPTL4具有抑制LPL活性的功能[20-23]，其抑制LPL活性的機(jī)制主要在于其存在His46、谷氨酰胺(Gln)50和Gln53這3個(gè)極性氨基酸殘基，它們可以將LPL從有活性的二聚體形式轉(zhuǎn)化成無(wú)活性的單體形式，從而阻止TG在脂肪細(xì)胞的沉積[5,20]。但在本試驗(yàn)中，翅靜脈注射500 ng/kg BW的雞ANGPTL4重組蛋白顯著增加了肉雞胸肌LPL活性，這與前人的研究結(jié)果ANGPTL4抑制人和小鼠LPL活性不一致。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，雞ANGPTL4的1～18氨基酸是信號(hào)肽，126～160和171～212氨基酸部位存在不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，253～473氨基酸是纖維蛋白原樣C末端，以BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)雞全長(zhǎng)ANGPTL4蛋白序列同人、小鼠的同源性低，均低于45%。由此猜測(cè)是因?yàn)殡u與人和小鼠的ANGPTL4蛋白序列不同，所以導(dǎo)致不同物種間ANGPTL4對(duì)LPL的作用呈現(xiàn)截然不同的效果。另外試驗(yàn)使用的是帶有His-SUMO標(biāo)簽的雞ANGPTL4重組蛋白，這個(gè)標(biāo)簽也可能影響雞ANGPTL4對(duì)LPL的作用。通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，雞ANGPTL4本身具有促進(jìn)肉雞胸肌TG沉積的作用，這正與體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的雞ANGPTL4促進(jìn)LPL活性的結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

雞ANGPTL4重組蛋白具有促進(jìn)肉雞肝臟和胸肌脂肪沉積的作用，且以500 ng/kg BW注射劑量效果較好。