史亞晶 史大偉 王媛媛 吳鳳芝 周新剛*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2 中國(guó)鐵路哈爾濱局集團(tuán)有限公司農(nóng)林管理所，黑龍江哈爾濱 150000）

植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是自由生活在土壤中或附生于植物根際的一類(lèi)可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量、改良土壤的細(xì)菌（Helman et al.，2012；Goswami et al.，2016）。多數(shù)PGPR 可通過(guò)固氮、產(chǎn)生鐵載體、溶解礦物不溶性磷酸鹽、產(chǎn)生植物激素如吲哚乙酸、合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶等促生長(zhǎng)特性（Christine &Marco，2005；Wang et al.，2018），增加土壤養(yǎng)分供應(yīng)，提高植物根表面積和對(duì)養(yǎng)分的吸收能力，以及改善土壤狀況等方式影響作物的生長(zhǎng)（Ortíz et al.，2008）。不同PGPR 菌株具有不同的促生特性，對(duì)植物的促生效應(yīng)亦不同（Paungfoo et al.，2019）。

根際微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性對(duì)植物生長(zhǎng)以及生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性有重要作用（Yao &Allen，2006；葛詩(shī)蓓 等，2020）。土壤微生物群落的組成與其功能有著緊密的聯(lián)系，土壤微生物群落組成的變化可能會(huì)改變?nèi)郝涞墓δ埽瑥亩鴮?duì)植物的適應(yīng)性產(chǎn)生反饋?zhàn)饔茫▽?duì)植物的營(yíng)養(yǎng)吸收、非生物及生物脅迫的耐受性（Sa et al.，2019）。土壤中外源施加的根際促生菌可以在植物根際存活增殖（Mandyal et al.，2012），同時(shí)會(huì)影響土壤中的常駐微生物，增強(qiáng)或抑制某些根際微生物的種群結(jié)構(gòu)（Zhao et al.，2017）。本試驗(yàn)以新羊角和辣妹子2種辣椒為試材，選用5 種PGPR 菌株，通過(guò)比較各菌株對(duì)辣椒植株生長(zhǎng)、葉綠素和養(yǎng)分含量的影響，篩選出對(duì)辣椒促生效果較好的菌株；并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了辣椒根際微生物群落組成，研究PGPR 對(duì)根際微生物的影響，以期為PGPR 在辣椒生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試PGPR 菌株的培養(yǎng)與菌劑制備

供試PGPR 菌株為P1 貝萊斯芽孢桿菌（）、P2 暹羅芽孢桿菌（）、P23特基拉芽孢桿菌（）、P33 枯草芽孢桿菌（）、P8 銅綠假單胞菌（），均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施蔬菜生理生態(tài)研究室提供。菌劑制備參考Khan 等（2019）的方法。5 種PGPR 菌株分別接種于LB 液體培養(yǎng)基中，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD=1）的細(xì)胞，4 ℃、7 000 r ·min溫和旋轉(zhuǎn)3 min，用0.9% NaCl 溶液洗滌3 次，然后重懸浮于無(wú)菌水中。

1.2 供試?yán)苯贩N子的滅菌與催芽

供試?yán)苯菲贩N為前期試驗(yàn)篩選出的對(duì)PGPR 菌株響應(yīng)效果較好的新羊角（Y）和辣妹子（L）（由哈爾濱市農(nóng)信種子公司提供）。挑選飽滿(mǎn)、無(wú)破損的種子，在10%漂白劑中浸泡30 min 進(jìn)行表面滅菌，用滅菌水沖洗干凈，55 ℃水浴30 min 后置于25～30 ℃恒溫箱中催芽，出芽率達(dá)到80%后播種于育苗盤(pán)中。

1.3 盆栽試驗(yàn)

2019 年4—6 月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站人工氣候室中進(jìn)行苗期盆栽試驗(yàn)。

以蛭石為栽培基質(zhì)，對(duì)5 種PGPR 菌株進(jìn)行篩選試驗(yàn)。分別對(duì)2 個(gè)辣椒品種進(jìn)行接種PGPR 菌株處理和不接種PGPR 菌株處理（CK），試驗(yàn)共12個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每重復(fù)5 盆，共180 盆。篩選出P1 菌株，以普通大田黑壤土為栽培基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。分別對(duì)2 個(gè)辣椒品種進(jìn)行接種P1 菌株處理和不接種P1 菌株處理（CK），試驗(yàn)共4 個(gè)處理，每處理重復(fù)3 次，每重復(fù)5 盆，共60 盆。

將具2 片真葉的辣椒幼苗定植于底部有孔的花盆（直徑8 cm、高7 cm）中，每盆1 株，栽培期間每盆每次澆灌50 mL Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液，每隔24 h 澆灌1 次。試驗(yàn)期間隨機(jī)更換盆栽的位置以減少試驗(yàn)誤差。幼苗3～4 片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的盆栽苗，分別取各菌株懸浮液10 mL 均勻澆灌辣椒根圍基質(zhì)和土壤，菌液濃度為1.0 × 10CFU · mL（Yao &Allen，2006），對(duì)照澆灌10 mL 的無(wú)菌水。

1.4 植株生理指標(biāo)的測(cè)定

不同PGPR 菌株處理20 d 后，分別測(cè)定辣椒植株株高、全株干質(zhì)量、葉片葉綠素含量及植株全氮和全磷含量。用清水沖洗粘附在根系上的基質(zhì)和土壤至干凈，吸水紙擦干后，用米尺測(cè)量植株莖基部至主莖生長(zhǎng)點(diǎn)之間的距離即為株高；取植株中部全展葉，采用分光光度法測(cè)定葉片葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量；將洗凈的植株放入烘箱，迅速升溫至105 ℃，保持30 min，然后降溫至80 ℃將樣品烘干至恒重，用電子天平稱(chēng)重；將烘干的植株樣品研磨，過(guò)0.3 mm 篩，再進(jìn)行HSO-HO高溫消煮，采用SKALAR 流動(dòng)分析儀測(cè)定植株全氮和全磷含量。

1.5 辣椒根際土壤的收集及其菌落DNA 提取

P1 菌株處理20 d 后將辣椒植株根部從花盆中輕輕取出，用手搖晃去除根系上的土壤，然后用無(wú)菌刷刷取緊貼根系的根際土壤（Zhou et al.，2019），每5 株的根際土壤混樣，-80 ℃保存?zhèn)溆谩８H土壤菌落DNA 的提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，USA）試劑盒。

1.6 根際土壤細(xì)菌和真菌的高通量測(cè)序

在Illumina MiSeq 平臺(tái)上通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)估計(jì)辣椒根際細(xì)菌和真菌群落組成。使用F515/R907引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的V4～V5 區(qū)（Muyzer et al.，1933），用FITS1/FITS2引物對(duì)真菌rRNA基因的ITS1 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增（Zhou et al.，2017）。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離條帶，使用DNA 膠純化試劑盒（Agarose Gel DNA Purificaion Kit，TakaRa）對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化后的產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Word、Excel 2016軟件進(jìn)行整理；使用IBM SPSS Statistics 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Tukey’s HSD 進(jìn)行方差分析，使用GraphPad Prism 5 軟件作圖。

高通量數(shù)據(jù)分析：alpha 多樣性分析使用QIIME 計(jì)算香濃指數(shù)，使用“edgeR”包的負(fù)二項(xiàng)式廣義對(duì)數(shù)線性模型的方法篩選與PGPR 處理的樣品間的差異OTU（Robinson et al.，2010）。使用R 軟件的“vegan”包基于Bray-Curtis 距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）（Jin et al.，2019）。并采用PERMANOVA（也稱(chēng)Adonis）分析PGPR 處理、辣椒品種以及交互作用對(duì)微生物群落組成的影響。所有序列均以生物項(xiàng)目登錄號(hào)PRJNA675151 收錄在NCBI-Sequence Read Archive 中。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同PGPR 菌株對(duì)辣椒生長(zhǎng)的影響

不同PGPR 菌株懸浮液澆灌20 d 后，除P8 菌株處理的辣妹子株高和P23 菌株處理的辣妹子干質(zhì)量與對(duì)照不顯著外，各菌株均較對(duì)照顯著提高了2個(gè)辣椒品種的株高和干質(zhì)量，其中P1 菌株的促進(jìn)作用最強(qiáng)（圖1）。

圖1 不同促生菌對(duì)辣椒株高和干質(zhì)量的影響

與對(duì)照相比，各菌株處理均顯著提高了2 個(gè)辣椒品種的葉片葉綠素含量和植株全氮、全磷含量。其中，P1 菌株處理顯著高于其他4 種菌株處理，促進(jìn)作用最強(qiáng)（圖2）。因此，本試驗(yàn)后續(xù)將針對(duì)P1 菌株對(duì)辣椒根際微生物的影響進(jìn)行研究。

圖2 不同PGPR 對(duì)辣椒葉片葉綠素含量和植株全氮、全磷含量的影響

2.2 P1 菌株對(duì)辣椒生長(zhǎng)及根際微生物的影響

2.2.1 P1 菌株對(duì)辣椒生長(zhǎng)的影響 P1 菌株接種20 d 后，與對(duì)照相比，P1 菌株除了對(duì)辣妹子的株高無(wú)顯著影響外，均顯著或極顯著提高了兩種辣椒的株高和干質(zhì)量（圖3）。

圖3 P1 菌株對(duì)辣椒株高和干質(zhì)量的影響

2.2.2 P1 菌株對(duì)辣椒根際微生物群落多樣性的影響 P1 菌株處理對(duì)2 個(gè)辣椒品種根際細(xì)菌和真菌群落alpha 多樣性指數(shù)（OTU 數(shù)量和香濃指數(shù)）無(wú)顯著影響（圖4）。辣椒根際細(xì)菌PCoA 顯示，接菌與未接菌樣本均被分開(kāi)。經(jīng)Adonis 分析表明，P1 菌株對(duì)辣椒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響（PERMANOVA，=0.311，=0.001），辣椒品種及其與促生菌處理的交互作用對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響（PERMANOVA，Variety，=0.108，=0.091；Trt × Variety，=0.056，=0.55）；而P1 菌株、辣椒品種及其交互作用對(duì)根際真菌結(jié)構(gòu)有顯著影響（PERMANOVA，Trt，=0.149，=0.001，Variety，=0.109，=0.034；Trt ×Variety，=0.116，=0.022）（圖5）。

圖4 P1 菌株對(duì)辣椒根際細(xì)菌和真菌OTU 數(shù)量和香濃指數(shù)的影響

圖5 P1 菌株對(duì)辣椒根際細(xì)菌和真菌多樣性的影響

2.2.3 P1 菌株對(duì)辣椒根際微生物群落細(xì)菌門(mén)和真菌綱水平相對(duì)豐度的影響 與對(duì)照相比，P1 菌株處理使2 個(gè)辣椒品種根際土壤細(xì)菌厚壁菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著提高；新羊角根際土壤細(xì)菌酸桿菌門(mén)和浮霉菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低（圖6-a）。與對(duì)照相比，P1 菌株處理使新羊角根際土壤真菌中的散囊菌綱的相對(duì)豐度顯著提高，傘菌綱的相對(duì)豐度顯著降低（圖6-b）。

圖6 P1 菌株對(duì)辣椒根際土壤主要細(xì)菌門(mén)和真菌綱相對(duì)豐度的影響

2.2.4 P1 菌株對(duì)辣椒根際微生物OTU 水平相對(duì)豐度的影響 P1 菌株處理提高了新羊角辣椒根際16 個(gè)細(xì)菌OTU 的相對(duì)豐度（圖7-a），其所在的門(mén)分別為擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）（圖7-b），主要為芽孢桿菌屬（）、溶桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、軍團(tuán)菌屬（）；降低了4 個(gè)細(xì)菌OTU 的相對(duì)豐度（圖7-a），其所在的門(mén)分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）和藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）（圖7-b），主要為甲基嬌美桿菌屬（Methylotenera）、鞘脂菌屬（）、新鞘脂菌屬（）。

P1 菌株處理提高了辣妹子辣椒根際20 個(gè)細(xì)菌OTU 的相對(duì)豐度（圖7-c），其所在的門(mén)分別為擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）（圖7-d），主要為芽孢桿菌屬（）、溶桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、硝化螺旋菌屬（）、原囊菌屬（）、假黃色單胞菌屬（）、假單胞菌屬（）；降低了10 個(gè)細(xì)菌OTU 相對(duì)豐度（圖7-c），其所在的門(mén)分別為酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）（圖7-b），所在的屬分別為擬孢囊菌屬（）、芽孢桿菌屬（）。

圖7 P1 菌株對(duì)辣椒根際細(xì)菌OTU 相對(duì)豐度的影響

P1 菌株處理提高了新羊角辣椒根際的3 個(gè)真菌OTU 的相對(duì)豐度（圖8-a），其所在的門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）和未分類(lèi)真菌（圖8-b）；降低了10 個(gè)真菌OTU 的相對(duì)豐度（圖8-a），其所在的門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、油壺菌門(mén)（Olpidiomycota）和未分類(lèi)真菌（圖8-b），主要為柄孢殼屬（）、被孢霉屬（）、枝鼻菌屬（）、鐮刀菌屬（）、小壺菌屬（）。P1 菌株處理提高了辣妹子辣椒根際4 個(gè)真菌OTU 的相對(duì)豐度（圖8-c），其所在的門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）和未分類(lèi)真菌（圖8-d）；降低了5 個(gè)真菌OTU 的相對(duì)豐度（圖8-c），其所在的門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、被孢菌門(mén)（Mortierellomycota）和未分類(lèi)真菌（圖8-d），主要為被孢霉屬（）和。

圖8 P1 菌株對(duì)辣椒根際真菌OTU 相對(duì)豐度的影響

3 結(jié)論與討論

不同PGPR 菌株的促生作用不同，它們可以通過(guò)直接和間接機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)，并對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、葉片光合性能和養(yǎng)分利用效率等生理功能有積極的影響（聶鑫和王偉，2017）。前人研究表明，PGPR 可以顯著提高辣椒植株的株高、干質(zhì)量和葉綠素含量（Mandyal et al.，2012；Zhao et al.，2019）；PGPR 菌劑灌根后辣椒的株高、干質(zhì)量均顯著高于未接種的對(duì)照植株（Wang et al.，2018；Abbaszadeh et al.，2019）；PGPR 菌株還可以顯著增加辣椒葉片的葉綠素含量（呂雅悠 等，2015）。本試驗(yàn)中，5 種PGPR 菌株均顯著提高了新羊角和辣妹子的葉片葉綠素含量，而且P1、P2、P33 菌株顯著提高了2 個(gè)辣椒品種的株高和干質(zhì)量，與前人研究結(jié)果一致。PGPR 可以使花生植株全氮、全磷含量顯著提高（韓麗珍 等，2019），本試驗(yàn)中5種PGPR 菌株均顯著提高了2 個(gè)辣椒品種的植株全氮、全磷含量，這可能是因?yàn)镻GPR 可以通過(guò)溶磷、固氮和解鉀的方式，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收（Hahm et al.，2012；Sabnis &Nagraj，2015），進(jìn)而增加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在葉片中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)葉綠素合成和光合作用，進(jìn)一步促進(jìn)植株生長(zhǎng)。有研究表明5種PGPR 菌株具有產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）、ACC 脫氨酶活性、鐵載體、固氮、解磷等功能，能積極促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分（Meng et al.，2016；聶鑫和王偉，2017；林志楷和林文珍，2019）。

作物品種也是影響PGPR 發(fā)揮有益功能的主要因素（Javed &Arshad，1997；Meyer et al.，2010）。例如，玉米雜交種能夠選擇其親本不能選擇的特定菌株，從而促進(jìn)植株生長(zhǎng)（Christine &Marco，2005）；不同小麥品種對(duì)PGPR 的響應(yīng)效果也存在差異（Akbari et al.，2020）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，同一菌株對(duì)不同辣椒品種的促生效果也不同。這可能是由于不同品種根系分泌物的種類(lèi)和含量存在差異，而這些根際分泌物又可以吸引不同的根際微生物并定殖到植物根際（Maria et al.，2005；Hao et al.，2010）。根際促生菌在植株根際的高效定殖，是發(fā)揮各種對(duì)植物有益功能的重要前提與否還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

土壤微生物群落組成的變化會(huì)影響植物的生長(zhǎng)與健康（Mendes et al.，2014）。根際細(xì)菌作為生物菌劑可以在植物根際存活增殖，也可以誘導(dǎo)植物根際微生物群落發(fā)生變化（Thokchom et al.，2017）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，P1 菌株處理顯著改變了辣椒根際細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，這與Ke 等（2019）將接種在玉米根際后顯著改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。植物根際可以通過(guò)增加有益微生物的相對(duì)豐度或減少植物病原體的相對(duì)豐度，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)（Bever et al.，2012）。本試驗(yàn)經(jīng)高通量測(cè)序分析表明，接種P1 菌株使辣椒根際擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）的相對(duì)豐度顯著提高，這4 種細(xì)菌門(mén)的多數(shù)成員通常表現(xiàn)出促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性（Zhang et al.，2019）。其中擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）種群數(shù)量是土壤健康的重要指標(biāo)之一，具有潛在的生物防治能力（Zheng et al.，2020）；藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）的多數(shù)成員能夠通過(guò)增加可溶性磷酸鹽在土壤中的積累、提高生物固氮作用的效率、增加根際可溶性鐵和鋅等物質(zhì)的含量進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)（Elkoca et al.，2007）；厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的成員，如芽孢桿菌能夠分泌抗生素或抗菌蛋白，是眾所周知的生物防治劑（Ahimou et al.，2000）。P1 菌株還可使辣椒根際土壤子囊菌門(mén)（Ascomycota）顯著富集，其中子囊菌是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中最重要的真菌（Hibbett et al.，2007）。

本試驗(yàn)中，P1 菌株對(duì)新羊角和辣妹子的植株生長(zhǎng)、葉片葉綠素含量、氮和磷吸收的促進(jìn)效果較好，并且改變了辣椒根際細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，提高了辣椒根際某些有益菌群的相對(duì)豐度。本試驗(yàn)主要采用盆栽方式，還需進(jìn)一步研究P1 菌株在田間對(duì)植株的促生效果。