田 瑩， 張國城， 吳 丹， 劉佳琪， 李晶晶， 霍勝偉， 沈上圯， 潘一廷

(1.北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院 國家生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)治理產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100029；2.北京大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871)

1 引 言

生物氣溶膠指的是源自生物體的固體氣載顆粒，包括微生物以及植物碎片和動(dòng)物皮屑等生物材料碎片[1]。病原性生物氣溶膠通過傳播感染人類，導(dǎo)致過敏、呼吸道疾病等，也會(huì)危害農(nóng)作物和牲畜，大大降低產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益[2]。目前最常見的實(shí)時(shí)生物氣溶膠監(jiān)測(cè)技術(shù)是激光誘導(dǎo)熒光。該技術(shù)使用單色光對(duì)通過儀器的單個(gè)顆粒的熒光特性進(jìn)行表征，根據(jù)特定波長范圍中顆粒物的熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)待檢粒子進(jìn)行判定。某些生物分子，特別是含有芳香環(huán)(即核黃素和幾種氨基酸)的分子熒光較強(qiáng)，而大多數(shù)非生物氣溶膠的熒光強(qiáng)度相當(dāng)?shù)蚚3]。

作為前端預(yù)警觸發(fā)器，生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀在生物防恐以及疾病防控方面都具有重大的意義。隨著新型冠狀病毒疫情的爆發(fā)，生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的市場(chǎng)需求量激增，但質(zhì)量參差不齊，無法保證儀器的準(zhǔn)確性。目前中國顆粒學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)“T/CSP 7-2020 顆粒技術(shù) 紫外熒光生物氣溶膠監(jiān)測(cè)技術(shù)要求”規(guī)定了紫外熒光生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的性能要求，但是尚未建立相應(yīng)的檢測(cè)方法和校準(zhǔn)規(guī)范[4,5]。

本文開展了生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀校準(zhǔn)方法的研究，一方面探索了細(xì)菌存活狀態(tài)對(duì)監(jiān)測(cè)儀熒光粒子讀數(shù)的影響；另一方面比對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR和菌落計(jì)數(shù)法對(duì)生物氣溶膠的檢測(cè)結(jié)果，并通過掃描電鏡，熒光染色等方法觀察采集瓶中細(xì)菌的狀態(tài)，從而為生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的量值溯源提供可靠的技術(shù)手段。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液的準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)菌是革蘭氏陰性菌大腸桿菌(ATCC 15597)和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(CGMCC 1.2465)。挑取單克隆菌落到30 mL的LB液體培養(yǎng)基中；在37 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)過夜，速度設(shè)為220 r/min；之后再將0.5 mL的菌液加入到25 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，以220 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行活化。得到的細(xì)菌懸液7 000 r/min離心5 min，去除培養(yǎng)基，用高壓滅菌的超純水清洗之后再次離心，重懸在50 mL的超純水中，用于霧化。最后利用BioSampler(SKC Inc.，ΜSA)采樣器采集生物氣溶膠，采樣的流量為12.5 L/min，采樣時(shí)間為30 min，采樣瓶中的介質(zhì)為20 mL的滅菌超純水。

2.2 菌落計(jì)數(shù)法

生物氣溶膠采樣器將細(xì)菌采集到液體介質(zhì)中，連續(xù)稀釋后取100 μL涂布到LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，形成肉眼可見的菌落，通過肉眼計(jì)數(shù)得到菌落個(gè)數(shù)，并根據(jù)采樣體積計(jì)算測(cè)量艙中可培養(yǎng)菌的濃度。具體可通過下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Cculturable為測(cè)量艙中可培養(yǎng)微生物氣溶膠的濃度；N代表平板上長出的菌落總數(shù)；DF為稀釋的倍數(shù)；Qsampler是采樣的流量；Tsampler是采樣的時(shí)間。

2.3 熒光光譜法

本文使用的是日立F-7000熒光分光光度計(jì)，選擇激發(fā)波長分比為280 nm和405 nm，光電倍增管電壓分別為400 V和700 V，掃描速度為1 200 nm/min。將高壓蒸汽滅菌前后的菌液用超純水清洗之后檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)樣本檢測(cè)時(shí)，靈敏度和特異性極高，能夠檢測(cè)出環(huán)境樣本中的大多數(shù)微生物[6]。qPCR實(shí)驗(yàn)可以對(duì)總的生物氣溶膠濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。BioSampler采集到的液體通過細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302，天根生化科技有限公司)提取總的基因組DNA，最終溶解到50 μL的超純水中。qPCR的反應(yīng)體系為50 μL，包括：5 μL上述DNA模版，1 μL 10 mmol/L的正向引物，1 μL 10 mmol/L的反向引物，1 μL 10 mmol/L的探針，25 μL的2× Taq PCR預(yù)混合液(KT201，天根生化科技有限公司)以及17 μL的超純水。整個(gè)qPCR實(shí)驗(yàn)在羅氏LightCycler 480儀器上進(jìn)行[7]。循環(huán)參數(shù)為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。所有的引物和探針都是由上海生工生物工程有限公司合成，具體的序列如表1所示。超純水作為qPCR實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照。通過直接顯微鏡計(jì)數(shù)得到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的濃度，連續(xù)10倍梯度稀釋后進(jìn)行DNA的提取，最終得到兩種細(xì)菌的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將采集到的液體4 000 r/min離心10 min中后提取DNA，總的生物氣溶膠濃度通過下式進(jìn)行計(jì)算：

表1 引物序列

Ctotal=Nqpcr/Vsampler

式中：Ctotal是測(cè)量艙內(nèi)總的生物氣溶膠濃度；Nqpcr是根據(jù)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的總細(xì)菌數(shù)量；Vsampler是采集到的空氣體積。

2.5 SEM電鏡

本研究使用電子掃描顯微鏡(Zeiss)對(duì)BioSampler采集前后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的微觀形態(tài)進(jìn)行觀察。將采集前后的菌液10 000 r/min下離心5 min去除上清，加入戊二醛(2.5%)覆蓋住樣品，放入4 ℃冰箱中固定6 h以上。去除戊二醛，依次加入30%，50%，70%，80%，90%，100%的酒精進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)梯度靜置10 min。脫水后將樣品放在恒溫培養(yǎng)箱中干燥，50 ℃干燥過夜，使水分充分蒸發(fā)。最后，取少量樣品置于硅片上送入電鏡室進(jìn)行觀察。

2.6 熒光顯微鏡

為了能夠更加直觀清晰地觀察BioSampler采樣前后細(xì)菌的狀態(tài)，使用熒光電子顯微鏡(Olympμs，IX83)進(jìn)行觀測(cè)。細(xì)菌細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒(Invitrogen，L7012)中含有SYTO 9綠色熒光核酸染料和PI紅色核酸染料[8]。細(xì)胞膜完好的正常細(xì)菌會(huì)染成綠色，而對(duì)于死亡或?qū)⑺赖募?xì)菌，細(xì)胞將被染成紅色。將采集前后的菌液10 000 r/min下離心5 min去除上清。用100 μL的PBS重懸，避光加入1 μL的綠色染料和1 μL的紅色染料。在37 ℃下避光孵育30 min。然后以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，PBS清洗一遍。最后取微量細(xì)胞懸液滴在蓋玻片上作為樣品，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)菌存活狀態(tài)對(duì)監(jiān)測(cè)儀的影響

生物粒子包含氨基酸，輔酶(NAD(P)H)以及核黃素化合物等，這些物質(zhì)在紫外光誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生熒光，這也是生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀區(qū)分生物粒子和非生物粒子的關(guān)鍵依據(jù)。色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸分別在280 nm、275 nm和260 nm左右的紫外光激發(fā)下熒光激發(fā)效率較高，產(chǎn)生的熒光發(fā)射光譜主要集中在280～650 nm波長范圍[9]。本實(shí)驗(yàn)中采用的某國產(chǎn)品牌生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的激發(fā)波長為405 nm，熒光發(fā)射波長為420～650 nm。

利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)高壓蒸汽滅活前后大腸桿菌菌液的熒光信號(hào)強(qiáng)度。280 nm激發(fā)光得到的大腸桿菌熒光光譜圖如圖1(a)所示，很明顯看到在330 nm處有一個(gè)單一的熒光峰。經(jīng)文獻(xiàn)查閱可知，苯丙氨酸的發(fā)射峰在280 nm附近，酪氨酸和色氨酸的發(fā)射峰分別在300 nm和350 nm附近?？梢钥闯觯竽c桿菌在336 nm附近出現(xiàn)的熒光峰是由酪氨酸和色氨酸疊加而形成的[10]，而且滅活前后菌液的熒光信號(hào)強(qiáng)度并沒有明顯的變化。圖1(b)是在405 nm激發(fā)下菌液的熒光光譜圖，大腸桿菌在470 nm處出現(xiàn)發(fā)射峰，整體熒光強(qiáng)度比較低，滅活后菌液的熒光信號(hào)低于滅活前，但并沒有完全消失。

同時(shí)，將滅活前后的大腸桿菌菌液分別經(jīng)過霧化后形成大腸桿菌氣溶膠，圖1(c)為大腸桿菌菌液霧化后，顆粒物傳感器和生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果?？梢钥闯鲱w粒物傳感器檢測(cè)兩者的濃度之間沒有明顯的差別；使用生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀，滅活之后檢測(cè)到的熒光個(gè)數(shù)稍低于滅活前的個(gè)數(shù)，這與熒光分光光度計(jì)的結(jié)果相一致。

圖1 不同狀態(tài)的細(xì)菌對(duì)監(jiān)測(cè)儀讀數(shù)的影響

這表明生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀對(duì)死細(xì)菌和活細(xì)菌有相似的響應(yīng)，并不能識(shí)別死細(xì)菌和活細(xì)菌，所以監(jiān)測(cè)儀測(cè)量的是氣溶膠的總細(xì)菌濃度(包括具有類似熒光性質(zhì)而無生命特征的顆粒物)。

目前菌落計(jì)數(shù)法作為重要的指示微生物的培養(yǎng)方法，廣泛用于生物防護(hù)和滅菌效果評(píng)價(jià)[11～13]，“GB/T 38517-2020顆粒 生物氣溶膠采樣和分析 通則”采用菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，“JJF 1826-2020空氣微生物采樣器校準(zhǔn)規(guī)范”利用菌落計(jì)數(shù)的方法評(píng)價(jià)空氣中細(xì)菌的濃度，即菌落計(jì)數(shù)法作為一種傳統(tǒng)方法[14,15]，廣泛用于空氣氣溶膠中細(xì)菌濃度的檢測(cè)；但是它得到的是活細(xì)菌的濃度，當(dāng)活細(xì)菌濃度和總細(xì)菌濃度差別較大時(shí)，該方法將不適用于氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的校準(zhǔn)。

3.2 細(xì)菌存活比例的研究

為了準(zhǔn)確定量測(cè)量氣溶膠中細(xì)菌總個(gè)數(shù)，采用準(zhǔn)確度更高的熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)基于擴(kuò)增反應(yīng)中熒光能量的傳遞，檢測(cè)每一次循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)，從而對(duì)DNA模板的起始濃度進(jìn)行定量，靈敏性和特異性高，廣泛用于臨床病原菌診斷和基因差異表達(dá)分析等生命科學(xué)領(lǐng)域[16]。qPCR基于樣品中DNA的濃度，因此檢測(cè)到的是總的細(xì)菌濃度，菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)的是可培養(yǎng)的細(xì)菌濃度。利用BioSampler采集霧化艙中的微生物氣溶膠，并對(duì)通過qPCR、菌落計(jì)數(shù)法得到的氣溶膠濃度與生物監(jiān)測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)值比對(duì)。

圖2(a)為qPCR、菌落計(jì)數(shù)法和生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)?？梢钥闯?，對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌這兩種細(xì)菌，qPCR檢測(cè)的生物氣溶膠濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菌落計(jì)數(shù)法和監(jiān)測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果，達(dá)到8.8×105CFU/L和5.5×105CFU/L；菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)的濃度只有6.3×104CFU/L和1.2×104CFU/L。圖2(b)給出了可培養(yǎng)細(xì)菌和總細(xì)菌的比值，可以看出可培養(yǎng)的細(xì)菌濃度與總細(xì)菌濃度的比值只有7.1%和2.8%，這可能是因?yàn)锽ioSampler在采樣過程中，由于沖擊式分離的作用，產(chǎn)生的沖擊力會(huì)對(duì)壓力敏感的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌產(chǎn)生影響，破壞菌體結(jié)構(gòu)，從而影響其可培養(yǎng)性，導(dǎo)致生物效率相對(duì)較低。之前也有文獻(xiàn)報(bào)道，沖擊式采樣器由于顆粒彈跳和再氣溶膠化或采樣器內(nèi)部表面的顆粒損失可能會(huì)超過50%[17]。由于生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀沒有辦法判定細(xì)菌的狀態(tài)，而廠家出廠時(shí)一般以菌落計(jì)數(shù)法作為校準(zhǔn)方法，導(dǎo)致監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果更接近于菌落計(jì)數(shù)法得到的濃度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于qPCR的結(jié)果。

圖2 不同生物檢測(cè)方法的比較

3.3 采樣前后SEM圖研究

細(xì)菌形態(tài)的變化是生存狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用掃描電子顯微鏡表征采樣器采集前后細(xì)菌形態(tài)的變化[18]。如圖3所示，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在采集前，細(xì)菌表面光滑完整；而采集后，一部分細(xì)胞表面開始發(fā)生變形，出現(xiàn)褶皺，外層破損。上述結(jié)果進(jìn)一步解釋了采集后可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于總細(xì)菌數(shù)的原因。

圖3 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌采集前(a和b)和采樣后(c和d)對(duì)比的掃描電鏡圖

3.4 采樣前后熒光顯微鏡研究

為了進(jìn)一步驗(yàn)證采集前后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌狀態(tài)的變化，通過熒光實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)細(xì)胞的存活情況。其中綠色熒光SYTO9可以進(jìn)入完整的細(xì)胞，而PI只能進(jìn)入受損的細(xì)胞中。因此，成活的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，而破損死亡的細(xì)菌發(fā)紅色熒光，根據(jù)綠色和紅色熒光比例的變化，可以評(píng)價(jià)采樣前后細(xì)菌的存活情況。如圖4所示，采集前細(xì)菌主要呈現(xiàn)的是綠色熒光，說明以成活細(xì)菌為主。而采集后，大腸桿菌的狀態(tài)更多的是介于存活和死亡之間，顏色呈黃色；金黃色葡萄球菌以死亡為主，主要呈現(xiàn)紅色。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與SEM圖保持一致，進(jìn)一步表明采集后細(xì)菌存活狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致很大一部分由于破損死亡而無法進(jìn)行培養(yǎng)。

圖4 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌采集前(a和b)和采樣后(c和d)對(duì)比的熒光顯微圖

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，生物氣溶膠采樣過程中由于力的沖擊可能會(huì)破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，從而影響其可培養(yǎng)性，導(dǎo)致生物效率相對(duì)較低，體現(xiàn)為菌落計(jì)數(shù)法得到結(jié)果遠(yuǎn)小于qPCR的測(cè)量結(jié)果。通過比對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌采樣前后掃描電鏡外觀圖和熒光顯微圖的變化，發(fā)現(xiàn)采樣后有細(xì)胞壁破裂，表明細(xì)菌受損的紅色熒光比例增加，采樣后有細(xì)菌發(fā)生受損死亡。生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀采用405 nm激光激發(fā)生物顆粒物產(chǎn)生熒光進(jìn)行檢測(cè)，但不能區(qū)分細(xì)菌的存活狀態(tài)，測(cè)量的是氣溶膠的總細(xì)菌數(shù)，而非活的細(xì)菌數(shù)。因此實(shí)時(shí)定量PCR相較于菌落計(jì)數(shù)法更適用于生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的校準(zhǔn)。