火兆燕，曹 萍，馬馨馨，王樹彬，厲書豪，邵貴榮，鐘鳳林*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州 350000;2 福建金品農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，福州 350000)

白菜類蔬菜包括大白菜(結(jié)球白菜)、小白菜(不結(jié)球白菜)、菜心、紫菜薹等，其中大白菜和小白菜是中國栽培廣泛的綠葉類蔬菜作物[1]。不結(jié)球白菜(Brassicassp.chinensis)又名小白菜，屬十字花科蕓薹屬[2]，適應(yīng)性廣，質(zhì)地鮮嫩，營養(yǎng)豐富，生長周期短，復(fù)種指數(shù)高，是國家菜藍(lán)子工程中重要的蔬菜作物之一[3]。不結(jié)球白菜喜冷涼氣候條件，多數(shù)品種生長的最適平均氣溫為18～20 ℃，28 ℃以上高溫條件下，節(jié)間伸長、生長遲緩，葉片易變黃、腐爛、味苦、病害嚴(yán)重，纖維含量明顯增加等，影響其商品性，給小白菜的生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的問題[4]。

表皮蠟質(zhì)是一種附著于植物表皮組織的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，作為植物組織的第一道保護(hù)性屏障，在抵御環(huán)境脅迫、保證植物正常生長發(fā)育等方面發(fā)揮著積極作用[5]。表皮蠟質(zhì)在植物的非生物和生物脅迫耐受中起著重要的作用，并參與了對過量紫外線輻射、高溫、細(xì)菌和真菌病原體、昆蟲、高鹽度和低溫等的防御機(jī)制[6-7]。有研究表明甘藍(lán)型油菜葉片蠟質(zhì)的積累有利于維持植株體內(nèi)水分平衡[8]。覆蓋在白菜葉片表面的蠟質(zhì)可以有效抑制害蟲的侵害[9]。擬南芥中蠟質(zhì)的積累，可以調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞滲透性，增強(qiáng)植株耐熱性[10]。表皮蠟質(zhì)具有阻止植株非氣孔水分流失，在植物抗逆性方面發(fā)揮重要作用[11]。目前在白菜中已鑒定出許多調(diào)控蠟質(zhì)合成關(guān)鍵基因，且證明其與植株生長發(fā)育和抗逆性密切相關(guān)，但其抗逆性生理機(jī)制尚不清晰。為此本研究通過對高溫脅迫下不結(jié)球白菜有蠟和無蠟材料表皮細(xì)胞形態(tài)及生理生化指標(biāo)的測定，明晰不結(jié)球白菜蠟質(zhì)響應(yīng)高溫脅迫的生理機(jī)制，為近一步探究蠟質(zhì)響應(yīng)高溫的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，也對不結(jié)球白菜耐熱品種的選育及設(shè)施栽培提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

不結(jié)球白菜有蠟材料Q28和無蠟材料Q1202來源于福建金品農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。試驗(yàn)于 2021年 4-6月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院公共實(shí)驗(yàn)室的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。將3葉1心健壯不結(jié)球白菜幼苗移栽到盆中，每盆1株，覆土5 cm左右，定植后澆透水進(jìn)行培養(yǎng)，晝/夜溫度為 25 ℃/18 ℃，空氣相對濕度為75%。4周后菜苗生長旺盛期進(jìn)行高溫處理。試驗(yàn)設(shè)高溫組(晝/夜溫度為37 ℃/30 ℃)和對照組(晝/夜溫度為25 ℃/18 ℃)，共處理9 d，每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)3株。在處理 3、6、和 9 d時(shí)分別采集植株的葉片，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。試驗(yàn)期間，控制人工氣候箱相對濕度為75%，光/暗周期為12 h/12 h，光合有效輻射為400 μmol·m-2·s-1。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 生物量及表皮細(xì)胞形態(tài)隨機(jī)選取5株幼苗分別取地上地下部擦干稱取鮮重后，放入烘箱105 ℃殺青15 min，后烘干至恒重，稱取干重。葉片表皮細(xì)胞形態(tài)用臺式掃描電子顯微鏡(TM3030 Plus，日本Hitachi 公司)進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.2 抗性生理指標(biāo)采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性[12]；采用浸泡法測定相對電導(dǎo)率[12]；采用硫酸蒽酮比色法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍(lán) G-250法測定可溶性蛋白含量[12]；采用茚三酮比色法測定脯氨酸(Pro)含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)含量[13]。

1.2.3 光合生理指標(biāo)采用比色法測定各處理不結(jié)球白菜葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量[14]。同時(shí)，用便攜式光合測定系統(tǒng)(Li-6400, Li-Cor,USA)在晴天上午10:00～11:00點(diǎn)測定其光合氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。測定時(shí)光強(qiáng)設(shè)為1 000 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，溫度為25 ℃，相對濕度50%～60%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析及作圖，運(yùn)用DPS(V3.01)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對兩種不結(jié)球白菜生物量的影響

隨著高溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，兩種不結(jié)球白菜材料幼苗干、鮮重均呈持續(xù)下降趨勢；干旱脅迫過程中，有蠟材料始終高于同期無蠟材料，且脅迫時(shí)間越長兩種材料差異越明顯(表1)。其中，在高溫脅迫9 d時(shí)，有蠟材料和無蠟材料的單株鮮重分別較高溫脅迫前(0 d)顯著降低17.58%和34.39%；有蠟材料的單株鮮重在高溫脅迫3、6、9 d時(shí)均顯著高于無蠟材料。同時(shí)，在高溫脅迫9 d時(shí)，無蠟材料和有蠟材料的單株干重較0 d分別降低31.14%和16.23%，無蠟材料下降幅度是有蠟材料的2.1倍；在高溫脅迫6、9 d時(shí)，有蠟材料單株干重均顯著高于無蠟材料。說明高溫脅迫后期，有蠟不結(jié)球白菜材料較無蠟材料更能平衡體內(nèi)水分散失和維持自身物質(zhì)積累以應(yīng)對高溫脅迫帶來的傷害。

2.2 高溫脅迫對兩種不結(jié)球白菜葉片表皮細(xì)胞形態(tài)的影響

當(dāng)植物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，葉片是最直接反映植株生長狀態(tài)的器官之一[15]。隨著高溫脅迫時(shí)間的延長，有蠟不結(jié)球白菜材料葉片表皮細(xì)胞形態(tài)由趨近飽滿狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變至輕微皺縮狀態(tài)；而無蠟不結(jié)球白菜材料表皮細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出更早更明顯皺縮狀態(tài)，在處理3 d時(shí)就出現(xiàn)明顯皺縮，至處理6 d時(shí)失水皺縮情況加深，到處理9 d時(shí)表皮細(xì)胞嚴(yán)重皺縮(圖1)。說明隨著高溫脅迫的持續(xù)，有蠟材料葉片表皮細(xì)胞完整性較好，損傷較小，葉片含水量較高，能夠通過自身調(diào)節(jié)來抵抗高溫環(huán)境。

2.3 高溫脅迫對兩種不結(jié)球白菜葉片滲透調(diào)節(jié)能力的影響

隨著高溫脅迫時(shí)間的延長，有蠟材料葉片的脯氨酸含量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，并在脅迫9 d時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)比處理前升高1.57倍；無蠟材料葉片的脯氨酸含量則呈先下降后升高的動態(tài)變化趨勢，但也在脅迫9 d時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)比處理前升高了85.84%；在高溫脅迫9 d時(shí)，有蠟材料的脯氨酸含量顯著高于無蠟材料(圖2,A)。在高溫脅迫后，有蠟材料葉片可溶性糖含量呈先降低后升高的趨勢，并在脅迫處理9 d達(dá)到最大值，此時(shí)比處理前升高10.75%；無蠟材料葉片可溶性糖含量呈先升高后下降的動態(tài)變化，在處理6 d時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)比處理前升高57.32%；在高溫脅迫0、3和9 d時(shí)，有蠟材料葉片的可溶性糖含量均顯著高于無蠟材料(圖2，B)。有蠟材料葉片可溶性蛋白含量呈先降低后升高再降低的變化趨勢，在脅迫處理6 d時(shí)大幅度升高并達(dá)到最大值，其在脅迫9 d時(shí)又大幅度降低，比處理前下降48.47%；無蠟材料葉片可溶性蛋白含量整體呈下降趨勢；在高溫脅迫6和9 d時(shí)，有蠟材料葉片可溶性蛋白含量均顯著高于無蠟材料(圖2，C)。以上結(jié)果說明不結(jié)球白菜葉片表面蠟質(zhì)的積累能在一定程度上提高植株的滲透調(diào)節(jié)能力。

2.4 高溫脅迫對不結(jié)球白菜葉片抗氧化酶活性和細(xì)胞膜透性的影響

圖3顯示，在高溫脅迫條件下，兩種不結(jié)球白菜葉片的SOD、POD、CAT活性均呈現(xiàn)先升高后下降的動態(tài)變化趨勢，有蠟材料始終高于無蠟材料，且兩者間差異大多達(dá)到顯著水平。其中，在高溫脅迫后，有蠟材料和無蠟材料葉片的SOD活性分別在高溫脅迫3 d和6 d時(shí)先后達(dá)到最大值，分別比處理前升高32.87%和29.9%(圖3，A)。兩份材料的POD活性均在高溫脅迫6 d時(shí)達(dá)到最大值，有蠟材料和無蠟材料葉片的POD活性分別比脅迫前升高了41.72%和32.15%；在高溫脅迫9 d時(shí)，無蠟材料葉片POD活性比處理前降低12.16%，而有蠟材料葉片POD活性仍比高溫處理前升高11.17%(圖3，B)。在高溫脅迫前后，有蠟材料葉片的CAT活性均顯著高于無蠟材料；有蠟材料葉片的CAT活性在脅迫前是無蠟材料的1.3倍；在高溫脅迫3 d后，兩種材料的CAT活性均達(dá)到峰值，有蠟材料和無蠟材料分別比高溫處理前升高53.26%和42.67%(圖3，C)。

同時(shí)，高溫脅迫后,兩種不結(jié)球白菜葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量(MDA)均呈逐漸上升趨勢，且無蠟材料的上升幅度更大。其中，有蠟材料葉片相對電導(dǎo)率在整個(gè)高溫脅迫期間上升較緩慢，在脅迫3～9 d均顯著低于同期無蠟材料，在高溫脅迫9 d相對電導(dǎo)率較無蠟材料低22.25%(圖3，D)。無蠟材料MDA含量在高溫脅迫下上升幅度更大，始終顯著高于有蠟材料(圖3，E)。

2.5 高溫脅迫對兩種不結(jié)球白菜葉片光合色素含量的影響

高溫脅迫下兩種不結(jié)球白菜葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均呈明顯下降的趨勢，且隨著脅迫時(shí)間的延長有蠟材料的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量明顯高于無蠟材料(圖4)。其中，在高溫脅迫9 d時(shí)，有蠟材料和無蠟材料的總?cè)~綠素含量分別較處理前下降43.9%和60.18%，且有蠟材料顯著高于無蠟材料(圖4，C)。同時(shí)，兩種不結(jié)球白菜葉片類胡蘿卜素含量隨著高溫脅迫的持續(xù)略有下降，但有蠟和無蠟材料之間不存在顯著差異(圖4，D)。

2.6 高溫脅迫對兩種不結(jié)球白菜葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

隨著高溫脅迫時(shí)間的延長，兩種不結(jié)球白菜品種葉片的Tr、Pn、Gs均呈逐漸下降趨勢(圖5)。其中，有蠟材料的Pn始終不同程度地高于同期的無蠟材料，且高溫脅迫6和9 d時(shí)達(dá)到顯著水平，此時(shí)分別是無蠟材料的1.27、1.32倍；有蠟材料的Tr和Gs在整個(gè)脅迫過程中均始終顯著低于同期無蠟材料，在高溫脅迫3、6和9 d時(shí)，無蠟材料的Tr分別是有蠟材料的1.12、1.22、1.50倍，Gs分別是有蠟材料的1.15、1.20、1.36倍。同時(shí)，經(jīng)不同天數(shù)的高溫脅迫后，2份不結(jié)球白菜材料葉片Ci均呈逐漸上升趨勢，且有蠟材料始終不同程度地低于無蠟材料，并在脅迫處理6和9 d時(shí)達(dá)到顯著水平；在高溫處理9 d時(shí)，有蠟材料和無蠟材料葉片Ci分別比處理前上升34.2%和83.6%。

3 討 論

植物在生長期間會受到很多非生物因素的影響，在眾多脅迫因素中，溫度是影響植物生長的重要因素之一[16]。高溫脅迫對植物生長的影響最終體現(xiàn)在植株生物量的積累上，因此植株生物量的變化能直接反映出植物對逆境的適應(yīng)能力[17-18]。馬寶鵬等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫后,辣椒的株高、地上地下部干鮮重以及壯苗指數(shù)均顯著降低。前人研究結(jié)果[20]表明，高溫對紫色不結(jié)球白菜品種的地上部生長有不同程度的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫后，有蠟和無蠟不結(jié)球白菜植株鮮干重均受到抑制，且隨著脅迫時(shí)間延長，抑制作用逐漸增強(qiáng)；在高溫脅迫6、9 d時(shí)，無蠟材料的單株干重顯著低于有蠟材料。

同時(shí),相對電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，與植物的抗逆性的大小密切相關(guān)[21]。在高溫環(huán)境下，植物體細(xì)胞膜膜脂組分發(fā)生變化，使細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞膜通透性增大，細(xì)胞失水皺縮，電解質(zhì)滲透率增大，從而導(dǎo)致電導(dǎo)率上升[22]。丙二醛是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度以及對逆境的反應(yīng)情況[23-24]。在本研究中，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長，有蠟不結(jié)球白菜材料葉片失水皺縮程度和相對電導(dǎo)率顯著小于無蠟材料，說明高溫脅迫下有蠟材料葉片的細(xì)胞膜完整性損傷較小，能夠通過自身調(diào)節(jié)抵抗高溫環(huán)境。同時(shí)，隨著高溫脅迫持續(xù)，無蠟材料葉片中 MDA含量的上升趨勢顯著高于有蠟材料，高溫脅迫處理9 d時(shí)MDA是有蠟材料的2倍。這表明高溫脅迫下無蠟材料的葉片細(xì)胞液外滲嚴(yán)重，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。

植物在遭受高溫、干旱、鹽堿等逆境時(shí)，會迅速積累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等一系列滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而提高植物防御能力[25]。脯氨酸的大量積累有利于平衡植物體內(nèi)滲透勢，具有降低細(xì)胞酸性、解氨毒、防止細(xì)胞脫水的作用[26]?？扇苄蕴峭ㄟ^滲透調(diào)節(jié)降低水勢，保證植物細(xì)胞的正常生理功能?？扇苄缘鞍拙哂芯S持植物體滲透壓、抗脫水的作用[27-28]。本研究結(jié)果表明，隨著高溫脅迫時(shí)間的增加，有蠟材料葉片脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的上升幅度都顯著高于無蠟材料。說明高溫脅迫下有蠟材料具有更好地調(diào)節(jié)細(xì)胞和環(huán)境滲透平衡、降低細(xì)胞膨壓、緩解高溫傷害的能力。

在一定程度上，植物體可以通過自身的抗氧化酶系統(tǒng)來防御高溫毒害作用，從而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有極強(qiáng)的氧化能力，它能將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫[29]。而存在于植物體內(nèi)的過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)能立即將有害的過氧化氫分解為水，SOD、CAT、POD便組成了一個(gè)完整的防氧化鏈[30]。因此，SOD、POD、CAT的活性水平在一定程度上代表了細(xì)胞清除活性氧自由基的能力，也間接反映了植物抗高溫的能力[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在高溫脅迫后，有蠟和無蠟不結(jié)球白菜葉片的SOD、POD 和 CAT 活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明對于短時(shí)間內(nèi)高溫植物可以通過提高自身防御機(jī)制來應(yīng)對脅迫。同時(shí)，有蠟材料葉片抗氧化酶活性的升高幅度均大于無蠟材料并始終高于處理前水平，又表明有蠟材料抵抗活性氧對機(jī)體傷害的能力較強(qiáng)，耐高溫性較強(qiáng)。

高溫可降低植物的光合作用。而葉綠素在植物光合作用的光吸收中起核心作用，其含量的高低直接影響植物葉片的光合作用[32]。研究表明，在高溫脅迫下，兩種不結(jié)球白菜葉綠素含量均下降，但仍以有蠟材料的含量較高。影響植物光合效率的因素主要有氣孔限制和非氣孔限制，氣孔限制因素引起的Pn下降表現(xiàn)為Gs、Ci、Tr的下降，非氣孔限制因素引起的Pn下降表現(xiàn)為Tr、Gs下降的同時(shí)Ci上升[33-34]。本研究結(jié)果表明，在高溫脅迫下，兩種不結(jié)球白菜葉片Pn、Gs和Tr顯著降低，Ci顯著上升，說明高溫脅迫下非氣孔因素是引起不結(jié)球白菜光合速率下降的主要原因[35]。隨著高溫脅迫的持續(xù)，有蠟材料的蒸騰速率相對較小，可能是因?yàn)槿~片上蠟質(zhì)的積累導(dǎo)致植株角質(zhì)層的滲透性降低，從而限制了蒸騰作用[36]。

4 結(jié) 論

高溫脅迫對有蠟和無蠟不結(jié)球白菜的葉片表皮形態(tài)、生理和光合水平均有不同程度的影響。對于2份材料而言，高溫脅迫下無蠟材料葉片表皮細(xì)胞的失水皺縮程度大于有蠟材料。但從生理指標(biāo)方面看，有蠟材料在高溫脅迫下的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸、抗氧化酶活性、凈光合速率都顯著高于無蠟材料。而無蠟材料在高溫脅迫下的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度明顯高于有蠟材料。在相同高溫脅迫條件下有蠟材料受傷害程度小于無蠟材料，是由于蠟質(zhì)保護(hù)葉片表皮細(xì)胞，平衡植株體內(nèi)水分散失，降低植株角質(zhì)層滲透，增強(qiáng)抗氧化能力，減少蒸騰速率，提高光合速率，使有蠟材料對高溫的適應(yīng)性優(yōu)于無蠟材料。本研究明晰了不結(jié)球白菜有蠟和無蠟材料在高溫脅迫下表皮細(xì)胞形態(tài)、生物量、生理水平的差異，揭示了蠟質(zhì)不結(jié)球白菜響應(yīng)高溫脅迫的相關(guān)生理機(jī)制，該研究結(jié)果為不結(jié)球白菜耐熱品種的選育以及進(jìn)一步分析不結(jié)球白菜表皮蠟質(zhì)響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。