童楨開，李 洋，蔡 斌，李新藝，黃美娟，黃海泉

(西南林業(yè)大學 園林園藝學院，國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術(shù)研究中心，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，西南林業(yè)大學園林園藝花卉研發(fā)中心，昆明 650224)

滇水金鳳(ImpatiensuliginosaFranch.)是中國所特有的鳳仙花科鳳仙花屬一年生草本植物，整株無毛，花色以紅色為主，斜卵形，旗形花瓣圓形，花瓣延長而形成的漏斗狀管狀結(jié)構(gòu)為花距[1]。花距是植物重要的觀賞特征之一。迄今為止發(fā)現(xiàn)滇水金鳳的野生種有著多種花距形態(tài)，如短距、直距和長距等[2]?；ň嗫梢允垢呒壩锓N的形成率變高，同時花距可以選擇自己需要的傳粉者，避免無用傳粉者浪費花蜜。對花距的研究有助于推斷物種形成和進化機制，有助于理解植物與傳粉者個體之間的相互作用，以及復雜的植物-傳粉者的群落機制。此外，花距還有調(diào)節(jié)生物入侵的重要功能[3]。但是到目前為止，除了有研究表明對花距發(fā)育有調(diào)控作用的KNOX基因外[4]，對于促進花距伸長和改變的調(diào)控基因還是未知。

生長素(auxin，indole acetic acid，IAA)是最早被鑒定出的一類植物激素，幾乎在植物生長發(fā)育各個階段都存在IAA響應基因的表達調(diào)控[5-6]。早期應答生長素基因(small auxin up RNA，SAUR)是植物IAA早期響應基因中最大的家族，1987年首次在IAA誘導處理的大豆下胚軸中發(fā)現(xiàn)SAUR表達[7-8]。目前，已經(jīng)在許多植物中鑒定出多個SAUR基因家族成員，例如擬南芥72個SAUR基因、水稻58個SAUR基因、玉米91個SAUR基因等[9-11]。由于國際上對鳳仙花屬植物的研究起步較晚，且滇水金鳳具有明顯的地域性，目前國內(nèi)外關(guān)于滇水金鳳的研究很少，主要有林瓊等[12]發(fā)現(xiàn)滇水金鳳種子具有休眠特性，Vieira等[13]首次報道了鳳仙花中黃酮類化合物的成分等。關(guān)于具有調(diào)控花距生長作用的SAUR基因的相關(guān)研究比較罕見。本研究對滇水金鳳花距發(fā)育SAUR基因進行鑒定和分析，旨在探明SAUR對花距生長發(fā)育調(diào)控的分子機制，為后續(xù)研究鳳仙花屬植物花距的生長發(fā)育調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

滇水金鳳(ImpatiensuliginosaFranch.)來源于昆明市撈魚河濕地公園及西南林業(yè)大學后山實驗大棚，取滇水金鳳花距器官，以滇水金鳳花苞期、花苞開放期、盛花期3個時期花的花苞(圖1)，取花距尖部、彎部、基部和檐部等4個部位進行試驗。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取與檢測提取不同時期不同部位的RNA，并在課題組前期研究基礎(chǔ)上設計出6對SAUR基因特異性引物(表1)，把RNA通過逆轉(zhuǎn)錄得到SAUR基因cDNA。另提取的滇水金鳳DNA核酸，以其為模板擴增得到滇水金鳳SAUR基因gDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進行連接反應，經(jīng)轉(zhuǎn)化、酶切和PCR鑒定后，結(jié)果與預期目的片段均相符者，送上海生工生物有限公司進行測序。

1.2.2SAUR基因的生物信息分析運用ExPasy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)軟件進行SAUR基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析；采用SignalP-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)進行蛋白序列信號肽預測；采用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因內(nèi)含子和外顯子預測；采用Protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)及DNAMAN軟件進行基因的同源比對分析；運用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 滇水金鳳SAUR基因的表達分析(1)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 提取滇水金鳳3個時期(花苞期、花苞開放期、盛花期)花距的檐部和距部，及盛花期花距的尖部、彎部、基部和檐部的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

(2)引物設計 根據(jù)已獲得的6個SAUR基因的cDNA全長序列，設計相關(guān)引物(表1)。

表1 滇水金鳳SAUR基因的引物序列

(3)熒光定量PCR 根據(jù)qRT-PCR的結(jié)果記錄下每組數(shù)據(jù)的Ct值，每組試驗重復3次。利用2-ΔΔct計算方法分析不同花距部位基因相對表達量。再對滇水金鳳SAUR基因的相對表達情況進行分析和制圖，將花苞期作為3個時期的對照組，將花距尖部作為2個花距的對照組，將其統(tǒng)一定為1個單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAUR基因總RNA提取及DNA擴增

對滇水金鳳總RNA提取結(jié)果測定濃度，其28S、18S rRNA條帶清晰，且二者亮度約成2倍關(guān)系，其提取質(zhì)量滿足后期試驗要求(圖2)。

結(jié)果表明，SAUR1、SAUR2、SAUR3、SAUR4、SAUR5和SAUR6各基因都位于300～500 bp，且均為單一條帶，其中cDNA序列全長分別為351、534、396、333、309和411 bp(圖3，A)。

以滇水金鳳DNA為模板，采用擴增引物(表1)進行全長gDNA PCR擴增，通過電泳檢測，得到的SAUR1、SAUR2、SAUR3、SAUR4、SAUR5和SAUR6基因的目的條帶位于300～500 bp，且均為單一條帶，說明是特異性擴增(圖3，B)。

2.2 滇水金鳳SAUR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

對SAUR基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示(表2)，根據(jù)各基因編碼蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)推測，除SAUR3基因編碼蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為37.30(<40)屬穩(wěn)定蛋白外，其他5個SAUR基因編碼蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)都大于40，皆為不穩(wěn)定蛋白。對滇水金鳳SAUR蛋白序列進行信號肽預測結(jié)果表明，所有氨基酸肽鏈上均不存在信號肽，因此滇水金鳳SAUR蛋白均屬于非分泌蛋白。對滇水金鳳SAUR基因編碼蛋白質(zhì)的親/疏水性分析結(jié)果顯示(表3)，除SAUR5蛋白的比例較低為-1.478，且總平均親水指數(shù)為0.045，屬于疏水性蛋白外，其余SAUR蛋白的比例較高，且總平均親水指數(shù)均為負值，屬于親水性蛋白。對滇水金鳳SAUR基因內(nèi)含子和外顯子進行分析，6個滇水金鳳SAUR基因家族成員均不含內(nèi)含子；對滇水金鳳SAUR蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析，6個 SAUR蛋白均屬于生長素誘導的超家族成員，其中SAUR3含有穩(wěn)定的PLN3219結(jié)構(gòu)域，其余5個SAUR蛋白均具有穩(wěn)定的PLN3090結(jié)構(gòu)域。

表2 滇水金鳳SAUR基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)

表3 滇水金鳳SAUR蛋白親/疏水性指標

2.3 滇水金鳳SAUR基因系統(tǒng)關(guān)系分析

對包含滇水金鳳、石榴、馬鈴薯等34個物種的氨基酸序列和系統(tǒng)親緣關(guān)系進行分析，結(jié)果(圖4)顯示：滇水金鳳SAUR1、SAUR2、SAUR3、SAUR4、SAUR5和SAUR6基因的氨基酸序列與其他植物的相似性分別為73.50%、65.68%、63.47%、82.80%、75.80%和47.34%，其中，SAUR6基因與其他6種植物的相似性最低為47.34%。SAUR4基因與其他5種植物的相似性為82.80%。而親緣關(guān)系樹包括3個分枝，SAUR1、SAUR4和SAUR5處于一個分枝，SAUR3和SAUR6處于一個分枝，SAUR2單獨處于一個分枝中。其中SAUR4和SAUR5處于同一個小分枝，推測其為旁系同源；而SAUR3和SAUR6在同一個分枝中的2個單獨分枝，推測其為直系同源。

2.4 滇水金鳳花距發(fā)育過程中SAUR基因的表達分析

2.4.1 不同時期距部及檐部的表達滇水金鳳6個SAUR基因在不同時期距部及檐部的表達情況如圖5。在距部，以花苞期為參照，隨著花開放時期的變化，基因SAUR1、SAUR3和SAUR5的相對表達量先上升后下降，而基因SAUR2、SAUR4和SAUR6則是先下降后上升?；騍AUR3在始花期和盛花期相對表達量分別為花苞期的5 878倍和5 694倍，有顯著性差異(P<0.005)。

在檐部，以花苞期為參照，隨著花的開放，所有6個SAUR基因的相對表達量均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且SAUR3、SAUR5和SAUR6基因始花期檐部的相對表達量均有較大上調(diào)，分別是花苞期的216倍、164.4倍和194.5倍，無顯著性差異。

從圖5不同時期不同部位的表達分析可知，相對始花期和盛花期，花苞期是表達量較低的一個時期；在距部(圖5，A)，SAUR1、SAUR3和SAUR5基因在始花期發(fā)揮作用，SAUR2、SAUR4和SAUR6基因則在盛花期發(fā)揮作用；而在檐部(圖5，B)，所有基因均在始花期發(fā)揮作用。推測在檐部SAUR基因于始花期促進細胞的分裂和伸長，而到了盛花期作用急劇減緩。

2.4.2 不同部位始花期及盛花期的表達滇水金鳳6個SAUR基因在始花期及盛花期不同部位中的表達情況如圖6。在始花期(圖6，A)，以花距尖部為參照，通過相對表達量可見，SAUR1-2基因在4個部位不表達或表達量很少；SAUR3基因彎部相對表達量約為6.5倍，其他部位表達量很少；SAUR4基因在4個部位均有一定量表達；SAUR5基因在4個部位均有一定量表達，檐部顯著增長，基部表達量高至36.0倍，有顯著性差異(P=0.029)；SAUR6基因在基部有較高表達量，在其他部位少量表達。

在盛花期(圖6，B)，以花距尖部為參照，通過相對表達量可見，SAUR1-3基因在4個部位表達量很少或不表達；SAUR4-6基因在幾個部位中相對表達量均較高，以SAUR5和SAUR6基因最高，尤其是SAUR6基因在檐部相對表達量高達339.4倍，有顯著性差異(P=0.013)；6個SAUR基因在尖部都有較穩(wěn)定的表達。

從圖6不同時期不同部位的表達分析可以看出，在始花期，除了SAUR5和SAUR6在花距基部有較高的表達，以及SAUR3花距彎部表達量較高外，其他部位各基因表達量并無太大區(qū)別；而在盛花期，SAUR5和SAUR6基因在花距各個部位都有著非常高的表達。推測在盛花期SAUR5和SAUR6基因在花距各個部位促進細胞的分裂和伸長。

3 討 論

本研究從滇水金鳳花距中克隆出6個SAUR基因特異全長，6個SAUR基因均不含內(nèi)含子，這與已報道的SAUR基因大多不含內(nèi)含子結(jié)論一致[14-15]。僅在部分物種中有不同，如擬南芥中有1個SAUR基因含有內(nèi)含子，玉米的58個SAUR基因中有6個，番茄的99個SAUR基因中有3個，馬鈴薯SAUR基因中的9個，柑桔的70個SAUR基因中有10個含有內(nèi)含子[7-8, 16-17]。研究表明，無內(nèi)含子基因的選擇性剪接發(fā)生率通常較低，某些SAUR家族基因的功能可能是穩(wěn)定的基因[18]，是否說明滇水金鳳中SAUR家族基因相較其他物種更為穩(wěn)定，這為后續(xù)探討該基因在鳳仙花屬植物中的表達模式及分子機理提供了一定參考。

大部分SAUR基因在啟動子區(qū)域含有幾個生長素反應性元件(AuxRE)[19]。大多SAUR蛋白包含的SSD特異性結(jié)構(gòu)域約60個氨基酸殘基，主要由疏水氨基酸組成，高度保守[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，除SAUR3為穩(wěn)定蛋白外，其他5個滇水金鳳SAUR蛋白成員均為不穩(wěn)定蛋白，除SAUR5為疏水性蛋白外，其余的5個均為親水性蛋白。所有基因都屬于生長素誘導的超家族成員，在對滇水金鳳6個SAUR蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，除了SAUR3含有穩(wěn)定的PLN3219結(jié)構(gòu)域，其余5個SAUR蛋白均有著穩(wěn)定的PLN3090結(jié)構(gòu)域，SAUR所有成員在蛋白結(jié)構(gòu)上的高度保守可能對其生物學功能的發(fā)揮有重要作用，這與Kant S[21]所報道的一致。

滇水金鳳6個SAUR基因的氨基酸序列分別與34種如罌粟、石榴、大麻等植物氨基酸序列進行對比分析，具有較高的相似性和種屬保守特征，但不同SAUR基因即使在同一物種內(nèi)也會存在較大差異[22]。本研究構(gòu)建SAUR基因系統(tǒng)發(fā)育樹中發(fā)現(xiàn)，SAUR1與罌粟處在一個小分枝中親緣關(guān)系較近。SAUR4和SAUR5處于一個小分枝中，與大麻親緣關(guān)系比較近；SAUR2與咖啡親緣關(guān)系較近；與SAUR3親緣關(guān)系較近的是木薯、橡膠樹和大葉櫟，而與SAUR6親緣關(guān)系較近的是水蜜桃、葡萄和澳洲棉等。有研究對植物SAUR基因的進化進行分析，發(fā)現(xiàn)苔蘚植物可能是植物的祖先，而SAUR基因在單子葉植物和真子葉植物中獨立存在[23]。研究為鳳仙花屬植物屬內(nèi)系統(tǒng)進化、親緣關(guān)系及種屬分類提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

SAUR的功能仍然是神秘的，前期有研究表明許多SAUR基因?qū)}、干旱和稻瘟病有響應。SAUR69通過抑制生長素的極性運輸來提高番茄果實對乙烯的敏感性，從而影響生長素-乙烯化的轉(zhuǎn)變，揭示了SAUR69介導了生長素和乙烯之間的關(guān)系[24]。SAUR26亞家族被鑒定為生長熱響應性，顯示與溫度相關(guān)的自然多態(tài)性，影響植物對當?shù)販囟冗m應的熱效應[25]。而本研究就SAUR基因?qū)Φ崴瘌P花距不同時期、不同部位的研究表明，細胞的分裂和伸長可能主要發(fā)生在始花期的檐部，且基因SAUR3發(fā)揮著非常重要的作用。而在水稻柱頭中也發(fā)現(xiàn)了OsSAUR54基因可能促進花粉管生長，在棉花中發(fā)現(xiàn)GhSAUR33同樣具有類似的功能[18, 26]。同時本研究中基因SAUR在檐部的表達模式可能是在始花期促進了細胞的分裂和伸長，而到了盛花期作用急劇減緩。從2個時期4個部位的表達分析中推測，SAUR基因?qū)ň嗟募毎姆至押蜕扉L的作用主要發(fā)生在基部和檐部；同時在不同時期花距不同部位中均檢測到了SAUR基因的表達，表明SAUR基因參與了植物生長和應激反應的多個過程，為滇水金鳳花距發(fā)育、物種形成和進化研究提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。