陶 鵬，趙彥婷，岳智臣，雷娟利，李必元

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

嫁接是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種常用的農(nóng)藝技術(shù)，也是科學(xué)研究中的一種研究手段[1-2]。構(gòu)建嫁接體是研究植物基因mRNA長距離運輸?shù)某Ｓ梅椒?，基于不同物種中的直系同源基因之間的序列差異，可研究mRNA在穗砧中的上下運輸[3]。利用擬南芥花序軸嫁接，通過RT-PCR檢測到GAI的mRNA在穗砧之間進(jìn)行了運輸[4]。利用蘋果樹嫁接檢測到IAA14基因的mRNA從砧木運輸?shù)浇铀胫衃5]。此外，一些開花基因的mRNA也被證實發(fā)生了長距離運輸。前人發(fā)現(xiàn)青花菜和擬南芥中AGL24的mRNA可在韌皮部中長距離運輸，在砧木中超表達(dá)AGL24，會促進(jìn)接穗提早開花[6]。SVP基因編碼了一種MADS-box轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在基因序列上與AGL24基因相似，但在調(diào)控開花時間上卻呈現(xiàn)相反功能[7-8]。擬南芥的SVP基因會作用于頂端分生組織并降低赤霉素的生物合成來抑制開花[9]。SVP與AGL24共表達(dá)在花發(fā)育早期，參與調(diào)控花器官的分化[10-11]。而在序列上類似于AGL24的SVP基因的mRNA是否會像AGL24 mRNA通過韌皮部進(jìn)行長距離運輸還有待揭示，驗證SVP基因mRNA長距離運輸可為深入研究SVPmRNA運輸?shù)姆肿訖C制打好基礎(chǔ)。

前期研究顯示，結(jié)球甘藍(lán)與菜心相互嫁接具有很好的親和力[12]，是研究BcSVP的mRNA在結(jié)球甘藍(lán)/菜心異源嫁接體中的長距離運輸?shù)那疤釛l件。本研究基于結(jié)球甘藍(lán)/結(jié)球甘藍(lán)嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖和菜心實生苗葉片的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)拼接獲得了結(jié)球甘藍(lán)BoSVP和菜心BcSVP的編碼區(qū)序列和3’UTR序列。利用結(jié)球甘藍(lán)和菜心SVP的種間差異序列，在異源嫁接體的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖的兩個文庫中篩選出了3條來自菜心的SVP基因的mRNA read。同時，比較分析了結(jié)球甘藍(lán)/結(jié)球甘藍(lán)嫁接和結(jié)球甘藍(lán)/菜心嫁接中接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖中內(nèi)源BoSVP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 結(jié)球甘藍(lán)/菜心嫁接及轉(zhuǎn)錄組測序取樣

將結(jié)球甘藍(lán)G27與49菜心種子播于穴盤中，生長45 d后，將甘藍(lán)G27的莖尖分別嫁接到49菜心的花序軸和結(jié)球甘藍(lán)G27的莖上(對照組)。嫁接后30 d，對結(jié)球甘藍(lán)/菜心嫁接體的甘藍(lán)莖尖(T01和T02)和結(jié)球甘藍(lán)/結(jié)球甘藍(lán)嫁接體的結(jié)球甘藍(lán)莖尖(T03和T04)進(jìn)行取樣，莖尖的長度約為2 cm，質(zhì)量大約0.38 g。取樣菜心實生苗的葉片(T05)。由百邁客公司完成RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測序工作。

1.2 菜心和結(jié)球甘藍(lán)SVP序列拼接

以白菜的BrSVP基因(Bra030228)序列作為參考序列，從菜心實生苗葉片的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(T05)中篩選菜心SVP的read，并拼接獲得菜心SVP基因(命名為BcSVP)的編碼序列以及3’UTR序列。再以BcSVP序列為準(zhǔn)，找到其在甘藍(lán)中的直系同源基因Bo4g149800。參考甘藍(lán)Bo4g149800序列，從結(jié)球甘藍(lán)/結(jié)球甘藍(lán)嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)的莖尖T03的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選獲得結(jié)球甘藍(lán)SVP基因的read，并拼接獲得結(jié)球甘藍(lán)SVP基因(命名為BoSVP)的編碼序列和3’UTR序列?；贐cSVP和BoSVP的編碼序列，翻譯獲得BcSVP和BoSVP蛋白的氨基酸序列，再使用ExPASy的在線軟件Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測BcSVP和BoSVP蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和等電點。

1.3 從砧木菜心運輸?shù)浇铀虢Y(jié)球甘藍(lán)中的BcSVP基因RNA read的識別與鑒定

由于BcSVP和BoSVP基因在3’UTR序列上有更大的差異，本研究在菜心BcSVP的3’UTR上選擇了一段41 nt的序列CF(Caixin forward sequence)及其反向互補序列CR(Caixin reverse sequence)作為檢索序列，使用UltraEdit軟件在異源嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖T01和T02中篩選菜心BcSVP的mRNA長距離運輸?shù)膔ead，并命名為Read1、Read2、……。為進(jìn)一步驗證從結(jié)球甘藍(lán)中篩選出來的read是來自于菜心的BcSVP序列，篩選出的read的序列使用ClustalX[13]再次與BcSVP和BoSVP序列進(jìn)行比對。如果read的序列與BcSVP序列一致，說明菜心的BcSVP的mRNA長距離運輸?shù)搅私铀虢Y(jié)球甘藍(lán)中。

1.4 結(jié)球甘藍(lán)內(nèi)源BoSVP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

使用菜心BcSVP的CF及其反向互補序列CR可以從接穗結(jié)球甘藍(lán)中篩選到發(fā)生長距離運輸?shù)腂cSVP的mRNA read。而與CF和CR的相對應(yīng)的結(jié)球甘藍(lán)BoSVP的GF(Ganlan forward sequence)和GR(Ganlan reverse sequence)則可用來篩選結(jié)球甘藍(lán)的BoSVPread。以GF和GR作為檢索序列使用UltraEdit軟件分別在T01、T02、T03和T04中進(jìn)行篩選BoSVPread數(shù)量，可以排除T01和T02中外源菜心BcSVP的read，獲得結(jié)球甘藍(lán)內(nèi)源BoSVP基因的read數(shù)量。再基于RPKM的計算方法獲得結(jié)球甘藍(lán)內(nèi)源BoSVP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。計算公式為map到GF和GR序列上的read數(shù)除以map到基因組上的所有read數(shù)(以million為單位)與檢索序列長度(以KB為單位)。使用Excel作圖，其中橫坐標(biāo)為生物樣品，縱坐標(biāo)為RPKM。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心BcSVP和結(jié)球甘藍(lán)BoSVP序列拼接及序列比較分析

使用白菜BrSVP基因(Bra030228)編碼序列在公共數(shù)據(jù)庫Ensembl Plants上檢索，獲得甘藍(lán)的Bo4g149800基因序列?；诠矓?shù)據(jù)庫的白菜SVP序列，從菜心葉片文庫T05拼接獲得了菜心BcSVP的編碼序列?；诠矓?shù)據(jù)庫的甘藍(lán)SVP基因序列，從結(jié)球甘藍(lán)/結(jié)球甘藍(lán)嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖的文庫T03中拼接獲得了結(jié)球甘藍(lán)BoSVP的編碼序列。通過序列比對，菜心BcSVP和結(jié)球甘藍(lán)BoSVP的編碼序列高度相似，僅有8個堿基的差異(圖1)。BcSVP和BoSVP蛋白在等電點和相對分子質(zhì)量上都極其相近，為一類相對分子質(zhì)量較小的酸性蛋白(表1)。

表1 菜心與結(jié)球甘藍(lán)的SVP基因的同源基因、基因定位及其編碼蛋白的等電點和相對分子質(zhì)量

2.2 菜心BcSVP和結(jié)球甘藍(lán)BoSVP基因種間差異序列的篩選

將菜心BcSVP和結(jié)球甘藍(lán)BoSVP的編碼序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，BcSVP和BoSVP的編碼區(qū)均有726個堿基，但兩者之間僅存在著8個堿基的差異(圖1)。而在BcSVP和BoSVP的3’UTR區(qū)， 240個堿基之間就有16個差異的堿基(圖2)。相比于編碼區(qū)，BcSVP和BoSVP的3’UTR區(qū)更適合篩選種間差異序列。為了盡可能避開選擇性加poly(A)尾對篩選異源運輸read的影響，本研究在菜心BcSVP的3’UTR上選擇最靠近終止子的一段長為41nt的序列作為檢測砧木菜心BcSVP的mRNA長距離運輸?shù)臋z索序列CF，考慮到測序結(jié)果中有正向和反向read，CF的反向互補序列CR也作為檢索序列。同時在結(jié)球甘藍(lán)BoSVP與CF和CR相對應(yīng)的位置上選擇一段40 nt的種間差異序列(GF和GR)，將作為分析接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖的內(nèi)源BoSVP轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的檢索序列。

起始密碼子和終止子分別用下劃線和方框表示。

終止子用方框表示，黑色背景顯示的是檢索序列GF的位置，而灰色背景顯示的是種間差異序列CF的位置。

2.3 菜心BcSVP和甘藍(lán)BoSVP基因mRNA運輸?shù)膔ead的識別及驗證

為分析菜心BcSVP基因的mRNA在結(jié)球甘藍(lán)/菜心嫁接體中的長距離運輸，使用CF和其反向互補序列CR序列在結(jié)球甘藍(lán)/結(jié)球甘藍(lán)嫁接體的結(jié)球甘藍(lán)莖尖T03和T04中進(jìn)行檢索，結(jié)果沒有檢索到來自菜心BcSVP基因的read。而分別以CF和CR在結(jié)球甘藍(lán)/菜心嫁接體的結(jié)球甘藍(lán)莖尖T01和T02的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索。結(jié)果顯示，CF在T01和T02中均沒有檢索到菜心的BcSVP基因的read。但使用CR進(jìn)行檢索，在T01和T02中分別獲得2個(Read1和Read2)和1個read(Read3)(圖3)。Read1和Read2分別位于T01文庫中的34740498和76178478。而Read3則位于T02文庫中的59545522。菜心Read1、Read2和Read3的長度均為150 nt(表2)。

圖3 使用CR序列進(jìn)行檢索在異源嫁接體的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖T01和T02文庫中檢索到的三個潛在的菜心BcSVP read

為了證實在結(jié)球甘藍(lán)中篩選出的3個read的確來自于菜心的BcSVP基因，本研究將Read1、Read2和Read3與BcSVP和BoSVP序列進(jìn)行比對(圖4)。Read1、Read2和Read3中分別有149、59和71個堿基位于3’UTR區(qū)。序列比對顯示Read1與菜心BcSVP完全一致，Read2和Read3與菜心BcSVP序列相比分別存在著1個和3個堿基的差異(表2)。而Read1、Read2和Read3與結(jié)球甘藍(lán)BoSVP序列相比分別存在著27、5、7個堿基序列的差異。說明使用CF與CR鑒定出來的運輸read是從砧木菜心中運輸?shù)浇铀虢Y(jié)球甘藍(lán)莖尖中的。

檢索序列CF和CR用黑色背景標(biāo)記。

表2 從異源嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖的T01和T02文庫中識別的來自菜心BcSVP基因read的相關(guān)信息

2.4 結(jié)球甘藍(lán)內(nèi)源BoSVP基因在同源嫁接和異源嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖中的表達(dá)

為了解同源嫁接和異源嫁接對接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖中BoSVP基因的表達(dá)影響，使用GF和GR序列(來自結(jié)球甘藍(lán)的BoSVP基因的種間差異序列)分別在異源嫁接和同源嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖(T01和T02；T03和T04)的轉(zhuǎn)錄組測序的Raw data中進(jìn)行檢索，結(jié)果如表3顯示，GF和GR在T01和T02中檢索到的read數(shù)量之和明顯多于在T03和T04中的數(shù)量之和。這些數(shù)據(jù)基于RPKM標(biāo)準(zhǔn)化后，顯示結(jié)球甘藍(lán)BoSVP在異源嫁接的莖尖T01和T02中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量分別為120.5和127.5，而在同源嫁接的莖尖T03和T04中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量分別為114.5和106.3，異源嫁接的接穗甘藍(lán)中的BoSVP表達(dá)量略微高于同源嫁接的接穗甘藍(lán)中的BoSVP表達(dá)量。

表3 不同種間差異序列在文庫中檢索到的數(shù)量

3 結(jié)論與討論

使用菜心BcSVP中的種間差異序列，在異源嫁接的接穗結(jié)球甘藍(lán)莖尖T01和T02中檢索到來自菜心的BcSVPread，通過序列比對進(jìn)一步證明異源嫁接的結(jié)球甘藍(lán)莖尖T01和T02中識別的3個read來自于砧木菜心。在異源嫁接體的接穗結(jié)球甘藍(lán)中的莖尖中出現(xiàn)菜心BcSVP的轉(zhuǎn)錄本read，說明菜心開花調(diào)控基因BcSVPmRNA從砧木菜心運輸?shù)搅私铀虢Y(jié)球甘藍(lán)莖尖中。目前已報道多個基因的mRNA可進(jìn)行長距離運輸并且發(fā)揮功能，比如開花啟動基因FT。擬南芥中FTmRNA可以從葉片通過韌皮部運輸?shù)角o尖，以調(diào)控光周期植物的開花[14]。青花菜中FVE基因的mRNA可在韌皮部中移動，在砧木中超表達(dá)FVE能促進(jìn)接穗的提前開花[6]。砧木菜心AGL24的mRNA運輸?shù)浇铀敫仕{(lán)的莖尖中[15]。因此，砧木菜心BcSVP的mRNA長距離運輸也可能會調(diào)控接穗甘藍(lán)的生長發(fā)育。

SVP和AGL24在序列上高度相似[7-8]，且兩者mRNA均可長距離運輸，暗示SVP和AGL24的mRNA長距離運輸可能與特定序列或結(jié)構(gòu)相關(guān)。最近研究顯示一些基因序列在單鏈mRNA狀態(tài)下可形成類似于tRNA的結(jié)構(gòu)，這些mRNA會在韌皮部中富集，并通過嫁接結(jié)合處在接穗和砧木之間進(jìn)行上下運輸[16]。馬鈴薯StBEL5 mRNA可在韌皮部中運輸，其3’UTR決定了其mRNA的穩(wěn)定性及其運輸?shù)礁哪芰17-18]。下一步識別和鑒定SVP基因mRNA運輸?shù)奶囟ㄐ蛄泻徒Y(jié)構(gòu)，對于研究mRNA的長距離運輸分子機制具有重要的意義。