徐孝東 綜述 劉志紅 審校

腎臟是人類系統(tǒng)性自身免疫性疾病最常受累的器官,組織駐留免疫細(xì)胞是對局部損傷做出反應(yīng)的理想場所。固有免疫是啟動機(jī)體免疫應(yīng)答的先頭部隊,可對自身或外源性抗原做出快速而強(qiáng)有力地回應(yīng),加強(qiáng)固有免疫細(xì)胞對外源信號分子的響應(yīng)、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點分子和核心功能分子的發(fā)現(xiàn)對于理解腎臟器官區(qū)域免疫激活和疾病的發(fā)生機(jī)制都具有重要意義[1]。Toll 樣受體(TLR)是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的表面模式識別受體,通過識別損傷相關(guān)模式分子(PAMPs)觸發(fā)分子級聯(lián)事件來誘導(dǎo)促炎因子的合成和分泌,進(jìn)而激活固有免疫以清除病原體;而在無菌性炎癥中,TLR的持續(xù)活化又增加了自身免疫性疾病發(fā)生的危險。作為特異性單鏈核酸感受器,TLR7/8在腎臟固有細(xì)胞和免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá),是觸發(fā)腎臟器官區(qū)域免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點分子,其異常激活可導(dǎo)致多種腎臟疾病[2]。本文就TLR7/8與腎臟疾病的關(guān)系做一綜述,以進(jìn)一步揭示TLR7/8在腎臟器官區(qū)域免疫中的特性和相關(guān)機(jī)制。

TLR7/8信號通路及激活方式

至今已發(fā)現(xiàn)11種人源性TLR和13種鼠源性TLR[3]。與TLR家族其他成員不同,TLR7/8分布于內(nèi)體和溶酶體膜中,配體為單鏈RNA(ssRNA)。在蛋白結(jié)構(gòu)方面,TLR7/8均屬Ⅰ型跨膜糖蛋白,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。胞外區(qū)由富含亮氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列組成,其作用是識別PAMPs;胞內(nèi)區(qū)為核心區(qū)域,含有Toll和白細(xì)胞介素(IL)受體同源的結(jié)構(gòu)域(TIR)信號區(qū),負(fù)責(zé)激活下游信號級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)TLR7/8與配體結(jié)合后,通過髓樣分化因子88(MyD88)依次激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子6,最終通過核因子κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)三條信號途徑合成和分泌促炎因子(IL-6,TNF-α等)。促炎因子一方面可以誘導(dǎo)組織細(xì)胞損傷,另一方面又可吸引和募集更多的炎癥細(xì)胞到達(dá)炎癥部位,加重組織損傷程度;在無菌性炎癥中,TLR7/8的持續(xù)活化也可導(dǎo)致自身免疫性疾病[4]。雖然TLR7/8識別配體均為ssRNA,但激活方式有很大不同。

TLR7激活方式作為核酸感受器,TLR7的激活受到嚴(yán)格控制。生理情況下,TLR7以無活性的單體形式存在,與配體結(jié)合后引發(fā)單體二聚化,這是其激活的必要條件。TLR7為雙重核酸感受器,具備兩個配體結(jié)合位點。第一結(jié)合位點(1st)位于二聚體界面中心位置,配體為鳥苷(G);第二結(jié)合位點(2nd)靠近二聚體界面,配體為富含尿苷(U)的ssRNA(≥3-mer)。正常情況下,TLR7單體1st對G親和力較低,無法引起TLR7單體二聚化;但當(dāng)富含U的ssRNA片段與2nd結(jié)合后會使1st對G的親和力提高。所以,存在ssRNA時,G一旦與TLR7的1st結(jié)合,會使TLR7構(gòu)象發(fā)生改變,誘導(dǎo)單體二聚化,產(chǎn)生典型的“M”馬蹄樣結(jié)構(gòu)。最后TLR7通過二聚體的TIR結(jié)構(gòu)域之間的細(xì)胞內(nèi)相互作用誘導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)。TLR7所識別的為ssRNA降解產(chǎn)物,而并非完整的ssRNA序列(圖1)[5]。

圖1 TLR7激活機(jī)制[7]TLR7:Toll樣受休7;G:鳥苷；U：尿苷

除ssRNA外,TLR7也可被小分子化合物(如咪唑喹啉類)和G衍生物激活。小分子化合物與TLR7的親和力遠(yuǎn)高于G,原因歸因于小分子化合物比G增加了烷基基團(tuán),它可以插入到受體的疏水口袋內(nèi),增強(qiáng)與TLR7的1st親和力。例如,TLR7對G和雷西莫特(R848)的親和力(Kd)分別為 13.5 μM和0.49 μM,與R848的親和力約為G的27.6倍,在高度親和力的作用下即使缺乏ssRNA也可直接誘導(dǎo)TLR7單體發(fā)生二聚化和激活。但TLR7對G的親和力可以通過ssRNA的結(jié)合顯著增加,比如TLR7與ssRNA結(jié)合后其1st對G的Kd從13.5 μM提高到0.93 μM,親和力提高了14.5倍[5]。這也就是說明,1st是所有類型配體激活TLR7所必需的,而2nd僅是ssRNA誘導(dǎo)激活所必需的。

通過TLR7對ssRNA序列識別偏好性分析發(fā)現(xiàn),UUU基序為TLR7 2nd識別的最小核酸序列,位于中間的U2與TLR7 2nd的氨基酸殘基之間形成氫鍵被嚴(yán)格識別,不能被其他核苷替換,而側(cè)翼的U1和U3被松散識別,允許被其他核苷替換。此外,研究發(fā)現(xiàn)攜帶三個U-ssRNA激活TLR7的能力最強(qiáng),攜帶兩個U-ssRNA又比攜帶一個U-ssRNA展現(xiàn)出較強(qiáng)的TLR7激活能力,但值得注意的是,一些攜帶一個U-ssRNA序列仍然會展現(xiàn)出一定程度的TLR7激活能力。比如含有CUC基序ssRNA比含有GUG/AUA基序的ssRNA具備更強(qiáng)的TLR7激活能力。綜合晶體學(xué)、生物物理學(xué)和細(xì)胞實驗數(shù)據(jù)建立的TLR7-ssRNA序列偏好性的模型認(rèn)為:TLR7 2nd的所識別第一個核苷優(yōu)選U,其次為 C/A/G;第二個位置嚴(yán)選U;第三個位置優(yōu)選U和C,其次為A和G;也就是說ssRNA 基序與TLR7親和力大小依次為:UU (U/C)(高強(qiáng)度結(jié)合)>UU (G/A)(中度結(jié)合)>XUX (減弱或無結(jié)合;X代表A、G或C)[6]。

TLR8激活方式盡管TLR8與TLR7結(jié)構(gòu)及識別配體相似,但激活機(jī)制有所區(qū)別。生理情況下,TLR8以二聚體形式存在,在沒有配體結(jié)合前TLR8二聚體胞內(nèi)段TIR信號域距離較遠(yuǎn),沒有生物活性;當(dāng)TLR8二聚體與配體協(xié)同激活后,二聚體胞內(nèi)段TIR信號區(qū)域相互靠近,進(jìn)而募集下游MyD88接頭蛋白觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)[7]。TLR8在人類和小鼠中的作用存在重要差異,比如人類TLR8可通過識別ssRNA介導(dǎo)宿主天然免疫,但小鼠TLR8對ssRNA刺激不敏感。原因在于嚙齒類動物TLR8缺乏識別配體過程中起著重要作用的5個保守氨基酸基序(RQSYA)[8]。本文主要就人類TLR8進(jìn)行闡述。

TLR8也具備兩個配體結(jié)合位點,為雙配體協(xié)同激活[7]。1st位于二聚化界面的中心,配體為ssRNA降解產(chǎn)物U;2nd位于二聚體的凹面上,配體為含RU基序(R為嘌呤,代表G或A)的ssRNA。生理情況下,TLR8 1st對U親和力較弱,在缺乏RU-ssRNA片段的情況下無法與1st結(jié)合;但當(dāng)RU-ssRNA片段與TLR8 2nd結(jié)合后則會顯著提高1st對U的親和力,當(dāng)TLR8被雙位點協(xié)同激活后,胞內(nèi)段TIR信號域發(fā)生構(gòu)象變化而相互靠近,從而觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)。比如,Li等[9]報道ssRNA120 (GUCUGAGUGUGUUCUUG)可激活TLR8并誘導(dǎo)TNF-α的釋放,而將U 替代為A的fake RNA120 (GACAGAGAGAGAACAAG)則失去了對TLR8激活的能力(圖2)。

圖2 TLR8的激活機(jī)制[11]TLR8:Toll樣受休8;U：尿苷

盡管TLR8 1st表現(xiàn)出對U的偏好性,但TLR8對U的親和力(Kd=55 μM)仍然低于小分子化合物(如R848的Kd=0.20 μM)。在ssRNA存在的情況下,TLR8對U的Kd值可以增加達(dá)到1.0 μM,這意味著在生理條件下,U不能單獨激活TLR8,但ssRNA的存在彌補(bǔ)了U相對較低的親和力的缺點;而小分子化合物本身與TLR8 1st的親和力足夠高,所以在缺乏ssRNA的情況下仍可以激活TLR8。這些結(jié)果表明,若ssRNA激活TLR8則必須結(jié)合2兩個識別位點,而小分子化合物僅需要與1st結(jié)合即可[7]。

既然TLR8通過兩個不同的結(jié)合位點來感知RNA降解產(chǎn)物,這表明不同ssRNA對TLR8的刺激可能涉及到一種共同的RNA降解途徑。研究表明,核糖核酸內(nèi)切酶(RNase T2)是TLR8識別RNA分子的關(guān)鍵上游成分,它在有核細(xì)胞中廣泛表達(dá)。由于RNase T2對ssRNA中的RU基序具有獨特的底物特異性,RNase T2優(yōu)先在R-U之間裂解ssRNA分子,產(chǎn)生R-2’,3’-環(huán)磷酸末端片段,這些寡核苷酸構(gòu)成了TLR8 2nd的理想配體;此外,RNase T2也會增加對U-磷酸(U>p)的分解代謝,這是激活TLR8的另一個先決條件[10]。TLR8 2nd能容納R端殘基的二核苷酸和三核苷酸,而R之前的核苷酸優(yōu)選U,其次為R(例如(U)UR>p)。通過對TLR8 2nd所識別的ssRNA 基序長度發(fā)現(xiàn),(U)URU構(gòu)成了ssRNA激活TLR8的最短基序[10]。但另一項研究認(rèn)為,RNase T2除了可以在R-U殘基之間裂解,也可以在嘧啶(Y,代表C或U)-U之間裂解,剪切位點發(fā)生在U之前。另一種核酸酶RNase 2與RNase T2協(xié)同互補(bǔ),裂解作用位點發(fā)生在U之后,在兩種核酸酶的作用下導(dǎo)致ssRNA 協(xié)同釋放U和ssRNA短鏈[11]。

TLR7/8與腎臟疾病

TLR7與腎臟疾病Tlr7基因位于X染色體,主要在B細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)中表達(dá),所以女性中的表達(dá)量要高于男性,而暴露于TLR7激動劑的女性B細(xì)胞比來自男性的B細(xì)胞會更有效地分化為抗體分泌細(xì)胞[12];這也是女性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患病率要高于男性的主要因素之一[13]。

TLR7與自身免疫性疾病中的關(guān)系已在SLE小鼠模型中得到充分闡述。比如自身抗原可在B細(xì)胞表面被B細(xì)胞抗原受體(BCR)識別,從而啟動其細(xì)胞內(nèi)化過程,一旦進(jìn)入內(nèi)體,自身抗原可激活B細(xì)胞中的TLR7,使B細(xì)胞優(yōu)先被招募到生發(fā)中心并分化為CD138+漿母細(xì)胞,增加個體對SLE的易感性[14]。在MRL/lpr小鼠模型中,適度增加Tlr7基因拷貝量可促進(jìn)具有RNA特異性的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞的增殖,產(chǎn)生以抗U1小核糖核蛋白抗體(抗RNP抗體)積累為特征的狼瘡樣綜合征[15];大量增加Tlr7基因拷貝量則可發(fā)生致死性炎癥反應(yīng),而敲除Tlr7基因可緩解疾病進(jìn)展和病情嚴(yán)重程度,并減少針對自身RNA抗原的抗體水平,抑制淋巴細(xì)胞的激活和血清IgG含量[16-17],但不會降低抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體的水平,因為ds-DNA抗體的產(chǎn)生取決于TLR9的表達(dá)[18]。本研究團(tuán)隊近期的一項臨床研究表明,由霉酚酸酯、他克莫司和類固醇組成的多靶點療法比單藥常規(guī)治療更能有效地實現(xiàn)重癥狼瘡性腎炎(LN)患者的完全緩解。為了探索多靶點療法的潛在分子機(jī)制,本研究團(tuán)隊采用單一療法或多靶點療法對MRL/lpr小鼠進(jìn)行治療,研究發(fā)現(xiàn)與單一療法相比,多靶點療法能顯著改善腎臟預(yù)后,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示,多靶點療法能顯著抑制小鼠腎臟中的TLR7表達(dá)和下游IL-6/Stat3通路激活。隨后該結(jié)論在LN患者的腎活檢組織樣本中進(jìn)一步得到驗證[19]。此外,TLR7同樣在糖尿病中扮演著非常重要的調(diào)控作用,比如與野生型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠相比,Tlr7-/-NOD小鼠的發(fā)病時間明顯延遲,1型糖尿病的發(fā)病率也顯著降低;分子機(jī)制研究表明Tlr7基因敲除促進(jìn)了B細(xì)胞PD-L1的表達(dá),以此來抑制CD4+T細(xì)胞的增殖;并通過下調(diào)B細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的表達(dá)減弱其抗原呈遞功能,抑制細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的增殖與激活。因此,靶向TLR7的治療可能有助于糖尿病的預(yù)防[20]。Zheng等[21]研究發(fā)現(xiàn),IgA腎病患者腎組織中浸潤的B細(xì)胞表達(dá)TLR7水平與腎功能[估算的腎小球濾過率(eGFR)和血清肌酐]及腎組織病理學(xué)指標(biāo)(腎小管萎縮、白細(xì)胞浸潤、腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化)密切相關(guān);浸潤的TLR7+CD19+B細(xì)胞不僅在腎臟中上調(diào)炎癥因子分泌水平,而且還可通過TLR7-GALT2軸促進(jìn)半乳糖缺乏型IgA1的合成,加重IgA腎病患者炎癥程度和促進(jìn)疾病進(jìn)程。

微小RNA(miRNA)作為ssRNA的一種特殊形式,除了在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的常規(guī)作用,還可以直接作為TLR7的生理配體。最近的研究表明,具有富含UG序列的成熟miRNAs也能激活TLR7。例如,miR-21、miR-29a、miR-25-3p和miR-92a-3p均富含UG序列,可以作為小鼠TLR7配體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎因子[22-23]。Lehmann等[24]發(fā)現(xiàn)富含UG序列miRNA let-7b在神經(jīng)元中作為TLR7信號的有效激活因子,誘導(dǎo)神經(jīng)變性。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞受損后會以被動形式向循環(huán)中釋放大量的miR-122,miR-122被小鼠肺泡巨噬細(xì)胞吸收并作為配體激活TLR7,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M1極化和分泌大量炎性細(xì)胞因子(如TNF-α和IL-6)。通過組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肝損傷小鼠模型的腎臟也出現(xiàn)不同程度損傷,但是否由miR-122通過循環(huán)系統(tǒng)激活腎組織固有細(xì)胞或巨噬細(xì)胞TLR7而引起腎臟炎癥和組織損傷有待進(jìn)一步研究。

TLR8與腎臟疾病與TLR7不同,TLR8在pDCs和B細(xì)胞中不表達(dá),而在髓系細(xì)胞中大量表達(dá),如單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。因鼠源TLR8不識別ssRNA,為研究人源TLR8的分子機(jī)制,Guiducci等[26]建立了多株表達(dá)不同人源Tlr8(hTlr8)基因拷貝量的轉(zhuǎn)基因小鼠,研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)高拷貝量hTlr8的小鼠逐漸發(fā)展為消瘦性疾病,其胰腺、腎臟、唾液腺和關(guān)節(jié)部分出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥,腎組織病變類型主要為腎盂腎炎和腎小球腎炎,其疾病嚴(yán)重程度與hTlr8表達(dá)水平密切相關(guān)。隨后作者在細(xì)胞水平上證實hTlr8是通過上調(diào)樹突狀細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)以增強(qiáng)了對T細(xì)胞的激活作用。重要的是,雖然TLR7和TLR8在小鼠中的過度表達(dá)都會導(dǎo)致致死性炎癥反應(yīng),但疾病表型卻截然不同, Tlr7轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生腎小球腎炎、肝壞死和嚴(yán)重的貧血,但胰腺、關(guān)節(jié)和唾液腺不受影響,這使得腎小球腎炎成為兩種模型之間唯一的共同特征。另外在Tlr7轉(zhuǎn)基因小鼠中,剔除B細(xì)胞足以消除疾病癥狀,這表明在該模型中B細(xì)胞Tlr7的過度表達(dá)驅(qū)動了疾病發(fā)展。而在hTlr8轉(zhuǎn)基因小鼠中,B細(xì)胞表達(dá)非常低水平的hTLR8,并且不會擴(kuò)張或浸潤受累器官,所以B細(xì)胞不太可能扮演類似的中心角色。而單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的hTLR8激活及所分泌的細(xì)胞因子(IL12p70)可以誘導(dǎo)下游Th1細(xì)胞反應(yīng),促進(jìn)IL-18和IL-12p70的釋放,進(jìn)而觸發(fā)NK細(xì)胞釋放IFN-g[27]。所以推測hTlr8轉(zhuǎn)基因小鼠疾病發(fā)展的原因更有可能是DCs和巨噬細(xì)胞激活產(chǎn)生促炎因子以及促進(jìn)Th1啟動和分化導(dǎo)致的器官損傷所致[26]。

盡管鼠類TLR8(mTLR8)不能對ssRNA產(chǎn)生免疫反應(yīng),但有研究顯示,在狼瘡小鼠的腎組織中mTLR8 mRNA表達(dá)量及下游促炎因子水平要顯著高于正常對照組,而且其mRNA水平與足細(xì)胞功能標(biāo)志物(Nphs1、Nphs2和Synpo)水平呈顯著負(fù)相關(guān),與尿白蛋白量呈正相關(guān),研究結(jié)果提示mTlr8的過表達(dá)與足細(xì)胞損傷及疾病進(jìn)展相關(guān),但狼瘡小鼠mTLR8是如何激活的尚不清楚[28]。另一項研究指出,小鼠單側(cè)梗阻致使腎小球和血清miR-21水平升高。miR-21可通過激活足細(xì)胞TLR8信號通路并分泌炎性因子進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[29]。但此項研究尚缺乏miR-21激活足細(xì)胞TLR8的直接分子生物學(xué)實驗。

小結(jié)：腎臟作為機(jī)體一個功能復(fù)雜的重要器官,具備獨特的區(qū)域免疫學(xué)特性,對其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點分子和核心功能分子的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識對于理解組織器官區(qū)域免疫在特定疾病發(fā)生機(jī)制中的作用具有重要意義。進(jìn)一步闡明TLR7/8作為觸發(fā)區(qū)域免疫的關(guān)鍵因子在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用,將有助于提升對腎組織器官的區(qū)域免疫學(xué)特性的了解和促進(jìn)新免疫治療靶點的發(fā)現(xiàn)。